Sperimenta il BioLab Chi è il colpevole?

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1 Sperimenta il BioLab Chi è il colpevole? Università degli Studi di Milano Settore Didattico, via Celoria 20, Milano Laboratorio 105

2 Indice 1. Conoscenze propedeutiche 1.1 Cosa è il DNA p Struttura del DNA p Dal DNA al cromosoma p Aploidia e diploidia p Gene, locus, alleli p Polimorfismi p polimorfismi allelici p polimorfismi di sequenza (microsatelliti) p Genotipo e fenotipo p Quadro riassuntivo: geni, alleli, polimorfismi, genotipo, fenotipo p Replicazione del DNA p Le tecniche che utilizzeremo in laboratorio 2.1 PCR p termociclatori p Taq polimerasi p scelta dei primer p Elettroforesi p Chi è il colpevole? 3.1 Antefatto p DNA profiling (test del DNA) p Schema dei microsatelliti utilizzati p esercizi p Schema dell esperimento p Protocollo sperimentale p principali unità di misura in biologia cellulare e molecolare p strumentazione e materiale a disposizione p soluzioni e reagenti p preparazione del gel di agarosio p corsa elettroforetica p marcatore di peso molecolare di DNA utilizzato p Risultati p Interpretazione p domande di riepilogo p Norme generali di sicurezza in laboratorio p Quiz di autovalutazione p Glossario p Siti web utili p Concorso Una settimana da ricercatore p. 32 2

3 1. Conoscenze propedeutiche 1.1 Cos è il DNA? DNA sta per Deoxyribo Nucleic Acid; è una complessa sostanza chimica che si trova nel nucleo di tutte le cellule e porta l informazione per lo sviluppo degli organismi. Il DNA è il materiale ereditario responsabile delle caratteristiche degli individui e quindi delle somiglianze e differenze tra gli stessi. Il DNA è unico per ogni individuo e diverso da individuo a individuo, eccetto che per i gemelli monozigotici, il cui DNA è identico. Il DNA è visualizzato sotto forma di cromosomi durante la divisione cellulare. 1.2 Struttura del DNA La molecola del DNA è un polimero, ossia è un insieme di tanti monomeri: i nucleotidi. Ogni nucleotide è costituito da tre componenti: un gruppo fosfato, uno zucchero (desossiribosio) e una base azotata. La molecola di DNA è formata da due catene polinucleotidiche avvolte l una intorno all altra con andamento destrorso. Le due catene sono antiparallele, ossia i due singoli filamenti sono orientati uno in direzione 5 3 e l altro 3 5. Gli scheletri zucchero fosfato si trovano all esterno, le basi azotate all interno. Le basi delle due catene sono unite tra loro mediante legami a idrogeno (Fig. 1). Le basi sono complementari e il loro appaiamento è: A=T Adenina - Timina G C Guanina - Citosina L informazione genetica risiede nella sequenza di basi. 1.3 Dal DNA al cromosoma Fig. 1. Struttura della doppia elica del DNA. Ciascun cromosoma eucariotico contiene una lunga doppia elica di DNA che si estende da una estremità all altra del cromosoma stesso. La lunghezza complessiva del DNA, che costituisce i 46 cromosomi di una cellula umana è di circa 2 metri; ne deriva quindi la necessità di compattare (spiralizzare) la molecola affinché la sua lunghezza sia compatibile con le dimensioni del nucleo. Alla molecola di DNA sono associati gli istoni (proteine basiche), che sono essenziali per permettere l avvolgimento e il ripiegamento del DNA in strutture estremamente compatte, vale a dire i cromosomi, visibili solo durante la divisione cellulare. Il processo di spiralizzazione del DNA (Fig. 2) prevede livelli successivi di avvolgimento (compattamento). 3

4 a) b) c) d) Fig. 2 I livelli di organizzazione della cromatina che danno origine ad un cromosoma euariotico. a) Doppia elica di DNA b) Collana di perle di nucleosomi c) Fibre di nucleosomi addensati a forma di solenoide d) Domini ad anse e) Spirali condensate f) Cromosoma metafasico e) f) 1.4 Aploidia e diploidia Nel nucleo delle cellule somatiche della maggior degli organismi, i cromosomi sono presenti in coppie di membri morfologicamente simili, detti cromosomi omologhi. Nel nucleo dei gameti (cellule riproduttive, gli spermatozoi e le cellule uovo), ogni cromosoma è invece presente in singola copia. La condizione che si ritrova nelle cellule somatiche è detta diploidia, quella nei gameti aploidia. Un individuo diploide è quindi tale perché nelle sue cellule somatiche sono presenti due copie di ogni tipo di cromosoma. Nelle cellule somatiche umane osserviamo ad esempio 46 cromosomi, ovvero 23 paia. Un cromosoma di ciascuna coppia di cromosomi omologhi è ereditato dal genitore femminile e l altro dal genitore maschile. 4

5 1.5 Gene, locus, alleli Ogni cromosoma può essere immaginato come una successione lineare di geni o loci. Il gene è l unità ereditaria fondamentale e consiste di specifiche sequenze di nucleotidi. Il locus è la posizione, ovvero il sito occupato dal gene su un cromosoma. I due termini, gene e locus, sono sinonimi. Ogni paio di cromosomi contiene gli stessi geni nello stesso ordine lineare, ma non necessariamente in forma identica. Forme diverse di un gene sono dette alleli. Poiché in ogni individuo diploide sono presenti due alleli per ogni locus, due cromosomi omologhi possono portare alleli uguali (l individuo è detto omozigote) o diversi (l individuo è detto eterozigote) per uno stesso locus. 1.6 Polimorfismi Il termine polimorfismo significa esistenza di forme diverse. In genetica, il polimorfismo può essere analizzato a livello di proteina (polimorfismo proteico) oppure di materiale genetico (polimorfismo genetico). In questo secondo caso, le forme diverse (ossia le varianti genetiche) possono riguardare un gene, vale a dire un tratto di DNA codificante una proteina, oppure un tratto di DNA non codificante. Nel primo caso, si parla di polimorfismo allelico, nel secondo caso di polimorfismo del DNA. polimorfismo proteico Polimorfismo polimorfismo genetico polimorfismo allelico polimorfismo del DNA polimorfismi allelici Per polimorfismi allelici si intende l esistenza di due o più alleli diversi di uno stesso gene o locus. Gli alleli di un gene si formano uno dall altro per mutazione, ossia per variazione della sequenza nucleotidica di un gene. Gli alleli di un gene possono essere identificati a livello fenotipico, perché possono determinare fenotipi diversi, ad esempio capelli neri o biondi. Se gli alleli di un gene sono due, il polimorfismo si chiama polimorfismo biallelico. Se gli alleli sono in numero maggiore di due (come nel sistema di gruppo sanguigno ABO), il polimorfismo è detto polimorfismo multiallelico polimorfismi di sequenza (microsatelliti) Nel caso dei polimorfismi del DNA, contrariamente ai polimorfismi allelici, la variazione di sequenza nucleotidica avviene in genere in un tratto di DNA non codificante, che nel suo complesso costituisce circa il 98% del genoma. I polimorfismi del DNA sono quindi più frequenti dei polimorfismi allelici e conseguentemente più utili nella ricerca genetica. E stato osservato che il DNA di due individui differisce per circa un nucleotide ogni 500/1000. Poiché interessano generalmente il DNA non codificante, i polimorfismi del DNA rappresentano differenze tra individui, senza conseguenze sul fenotipo. Quindi, non è possibile rilevarli osservando le caratteristiche fenotipiche di un individuo. Esistono diversi tipi di polimorfismi del DNA: 1. polimorfismi di singoli nucleotidi = SNP (single nucleotide polymorphism) 2. polimorfismi di ripetizione = VNTR (V= variable, N= Number, T= Tandem, R= Repeats) 3. polimorfismi di restrizione = RFLP ( R= restrition, F= fragment, L= lenght, P= polymorphism) 5

6 Noi ci occuperemo solo dei polimorfismi di ripetizione (VNTR), vale a dire i polimorfismi dovuti alla presenza di un numero variabile di sequenze nucleotidiche ripetute in tandem (in orientamento testa-coda, una di seguito all'altra). I VNTR comprendono i microsatelliti e i minisatelliti, che differiscono tra loro per la lunghezza dell unità di ripetizione. Nei minisatelliti, le ripetizioni sono più lunghe (qualche decina o un centinaio di basi). Nei microsatelliti, le ripetizioni sono più corte, di-, tri- o tetra- nucleotidi, ad esempio (AC) n oppure (CAG)n. Per questo motivo, i microsatelliti sono detti anche STR (Short Tandem Repeats, ripetizioni brevi in tandem). Per un determinato microsatellite possono di conseguenza esistere numerosi alleli diversi, che differiscono tra loro per il numero di ripetizioni, ad esempio da 1 a 20 ripetizioni. I microsatelliti sono quindi un esempio di polimorfismo multiallelico. Il profilo del DNA ( DNA profiling ) serve per identificare gli individui e distinguere un individuo dall altro. Se due individui presentano caratteristiche simili, ad esempio hanno capelli dello stesso colore, occhi dello stesso colore, stessa altezza, stesso gruppo sanguigno ecc. non è possibile distinguerli. Caso estremo di individui con le stesse caratteristiche e quindi non distinguibili tra loro, è rappresentato dai gemelli identici, monozigotici. Ne consegue che per poter distinguere due individui, bisogna riferirsi a caratteristiche che siano diverse nei due soggetti. Le caratteristiche in esame nel caso del DNA profiling sono i microsatelliti. Due individui sono diversi tra loro, se posseggono alleli diversi dei singoli microsatelliti in esame, e quindi posseggono due alleli diversi dello stesso microsatellite. E intuitivo che tanto maggiore è il numero di alleli che esistono per un certo gene, tanto maggiore è la probabilità che un individuo sia eterozigote e quindi diverso da un altro individuo. Dato il loro elevato polimorfismo (elevato numero di alleli), i microsatelliti sono pertanto degli ottimi marcatori genetici, in quanto consentono di marcare, vale a dire distinguere tra loro due individui. I microsatelliti possono essere studiati con la PCR e successiva elettroforesi del DNA e sono utilizzati per effettuare il test del DNA (vedi 3.2). 1.7 Genotipo e fenotipo Il genotipo è la costituzione genetica di una singola cellula o di un singolo organismo, mentre il fenotipo è l insieme delle caratteristiche visibili o in qualche modo evidenziabili di una cellula o di un organismo. Ad esempio, fenotipo è non solo il colore degli occhi, il colore della pelle o l altezza (caratteristiche visibili), ma anche il tipo di gruppo sanguigno (caratteristica non visibile, ma evidenziabile con saggi di laboratorio), così pure i polimorfismi del DNA non si vedono osservando un individuo, ma possono essere evidenziati con la PCR e successiva elettroforesi (vedi 2.1 e 2.2). Il fenotipo non è determinato solo dai geni, ma dipende anche dall interazione del genotipo con l ambiente. La statura di una persona, ad esempio, è influenzata dai geni, tuttavia la loro espressione può essere modificata dalle interazioni con l ambiente esterno (ad esempio, alimentazione) o interno (ad esempio, ormoni). 6

7 1.8 Quadro riassuntivo: geni, alleli, polimorfismi, genotipo, fenotipo Diploide: in ogni individuo sono presenti due copie di ogni tipo di cromosoma e quindi due alleli di ogni locus Genetica classica A a Genetica molecolare 4 ripetizioni 7 ripetizioni Alleli: forme diverse dello stesso gene o locus 2 alleli diversi dello stesso locus: A e a 2 tratti di DNA dello stesso locus che differiscono per il numero di ripetizioni di una corta sequenza di basi Genotipo Aa 4,7 Fenotipo A nessuno Polimorfismo: esistenza di due o più varianti genetiche (alleli, sequenze nucleotidiche, ecc.) Polimorfismo allelico Polimorfismo di sequenza (microsatelliti) Come si evidenzia Osservazione dell individuo o delle sue cellule, ad es: colore degli occhi, gruppo sanguigno PCR ed elettroforesi 1.9 Replicazione del DNA La replicazione del DNA in tutte le cellule viventi, dai batteri all uomo, è un processo complesso, che richiede l intervento di più di una dozzina di enzimi diversi. La replicazione comincia in corrispondenza di siti detti origine di replicazione presenti ad intervalli lungo i cromosomi. In questi siti, alcune proteine srotolano la doppia elica di DNA, rompendo i legami a idrogeno tra le basi dei due filamenti complementari. 7

8 L allineamento e unione tra loro dei nucleotidi complementari avviene per azione della DNA polimerasi che procede solo in direzione 5 3. La DNA polimerasi per iniziare il processo ha anche bisogno di un innesco (detto anche primer), a cui attaccarsi e procedere con la polimerizzazione. Durante la replicazione del DNA, il primer è costituito da una corta sequenza polinucleotidica di RNA. La replicazione è semiconservativa: ogni emi-elica (singolo filamento) della molecola madre serve da stampo per la sintesi di un nuovo filamento, per cui ogni doppia elica figlia sarà costituita da un filamento vecchio e da un filamento nuovo. Le molecole risultanti sono copie esatte dell originale. Da una doppia elica madre derivano due doppie eliche figlie uguali tra loro e uguali alla molecola madre. Fig. 3. Rappresentazione grafica della replicazione del DNA, con la formazione dei due nuovi filamenti complementari ai filamenti stampo della molecola originaria. 2. Le tecniche che utilizzeremo in laboratorio 2.1 PCR (Polymerase Chain Reaction) Si tratta di una tecnica innovativa che consiste nell amplificazione specifica di tratti di DNA mediante reazioni a catena della DNA polimerasi. Il principio è molto semplice. Data una sequenza di DNA a doppio filamento e due corte sequenze oligonucleotidiche (primer), di cui una complementare ad un tratto di filamento ad una estremità del DNA da amplificare (forward primer) e l altra complementare ad un altro Numero di cicli Numero molecole della sequenza di DNA bersaglio tratto posto all alt ra estre mità (rever Fig. 6. Schema del processo di amplificazione di un frammento di DNA tramite PCR. se primer), in presenza di una DNA polimerasi termostabile e di una miscela di desossinucleotidi trifosfati in appropriate condizioni di reazione, è possibile far copiare numerosissime volte il tratto compreso tra i due primer, semplicemente facendo variare ciclicamente la temperatura di reazione. Infatti, raggiunta la temperatura di denaturazione (circa 95 C), la doppia elica si apre (fase di denaturazione), rendendo disponibile lo stampo per una eventuale sintesi delle catene complementari. Quando la temperatura si abbassa, in virtù delle loro minori dimensioni e della loro concentrazione, i primer si legheranno (fase di appaiamento o annealing) al DNA stampo prima che si 8

9 rinaturi e, in presenza di una DNA polimerasi con un optimum di temperatura elevato (circa 72 C), inizierà la sintesi di DNA a partire dai primer (fase di sintesi del DNA o extension), procedendo lungo i filamenti singoli. Al termine del primo ciclo di PCR da una doppia elica di DNA se ne ottengono due. Ripetendo il ciclo "denaturazione annealing extension" numerose volte (in genere da 20 a 30), si ottiene una massiccia amplificazione specifica di un dato tratto di DNA che può quindi essere analizzato e studiato in dettaglio. Il metodo di analisi del DNA mediante PCR presenta vantaggi molto evidenti: è molto rapido (da 60 a 90 minuti), la manualità è semplicissima, è automatizzato, i risultati sono visualizzabili con facilità mediante elettroforesi del DNA (vedi 2.2) Importanti ambiti di utilizzo della PCR sono la diagnosi prenatale di malattie genetiche e le indagini di medicina legale (sia civile che penale), termociclatori Il successo della PCR è dovuto in gran parte alla possibilità di far avvenire l intero processo in modo automatico all interno di strumenti detti termociclatori (thermal cycler), in grado di variare ciclicamente la temperatura tra le varie fasi di ogni ciclo di PCR. Il costo di un thermal cycler si aggira sui euro. Un esempio di profilo di amplificazione standard impostato mediante un termociclatore è il seguente: 1. denaturazione del DNA: 30 sec a 94 C 2. appaiamento (annealing) dei primers: 30 sec a C cicli 3. sintesi (extension) di DNA: 30 sec- 5 minuti a 72 C Taq polimerasi Il successo della PCR è stato possibile grazie anche all uso di una DNA polimerasi termostabile estratta da batteri termofili (che vivono ad elevate temperature). Una DNA polimerasi utilizzata nelle reazioni della PCR è la Taq polimerasi, estratta dal batterio Thermus aquaticus. L isolamento di DNA polimerasi termostabili ha sollevato gli operatori dall ingrato compito di aggiungere enzima fresco ad ogni ciclo di reazione! Zona amplificata scelta dei primer Per ogni PCR, è necessario usare due primer (forward e reverse). La scelta della coppia di primer è critica per una buona riuscita della PCR, ovvero per ottenere amplificazione specifica di un tratto di DNA. I primer devono essere disegnati a livello di sequenze uniche nel genoma (presenti una sola volta), in modo che possano appaiarsi al DNA solo nella zona di interesse e non in altre zone. 2.2 Elettroforesi E una tecnica che consente di separare in base alle loro dimensioni (peso molecolare) molecole dotate di carica, facendole migrare su un gel in presenza di un campo elettrico. Il gel è costituito generalmente da agarosio e può essere immaginato come una rete tridimensionale attraverso le cui maglie migrano le molecole sotto l azione di un campo elettrico. Il campo elettrico è generato da un apparecchio, detto alimentatore o power supply. Le molecole di DNA sono cariche negativamente per la presenza di gruppi fosfato e migrano dal polo negativo verso il polo positivo. 9 Fig. 8. Cella elettroforetica e alimentatore.

10 Per un certo intervallo di pesi molecolari, la velocità di migrazione è funzione del peso molecolare: tanto più grande è la molecola, tanto minore è la velocità di migrazione. E viceversa, tanto più piccola è la molecola di DNA, tanto più velocemente migra. Le molecole di DNA di diversa lunghezza vengono pertanto separate in base alla diversa velocità di migrazione. Per poter determinare la lunghezza delle molecole di DNA in esame precedentemente separate mediante elettroforesi, viene caricato sul gel anche il cosiddetto marcatore di peso molecolare, ossia una miscela di frammenti di DNA di cui è noto il peso molecolare. Confrontando la posizione dei frammenti a peso molecolare noto con quella dei frammenti di DNA in esame, è possibile calcolare il peso molecolare di questi ultimi, ossia la loro lunghezza. La separazione elettroforetica dura circa 30 min - 1 ora. Al termine, i vari frammenti di DNA, essendo incolori, possono essere visualizzati, immergendo il gel in un colorante. Il DNA delle diverse classi di peso molecolare è visibile sotto forma di bande distinte: sono le cosiddette bande di DNA. In genere in laboratorio le bande si visualizzano esponendo il gel alla luce ultravioletta. Questo è dovuto al fatto che, durante la preparazione del gel, all agarosio è stato aggiunto l Eurosafe, una sostanza che ha la proprietà di legarsi al DNA e di emettere fluorescenza se esposta a luce UV. Fig. 9. Osservazione del gel alla luce ultravioletta. 10

11 3. Chi è il colpevole? 3.1 Antefatto Gianni, un ragazzo di quindici anni, vince una gara di bicicletta e tornando a casa si imbatte in un gruppo di teppisti che vogliono rubargli il trofeo e la bici. Dopo una colluttazione conclusasi con il furto del trofeo al vincitore e la fuga dei teppisti, arriva il vigile di quartiere che soccorre il malcapitato e lo riaccompagna a casa. I genitori decidono di denunciare il fatto alla polizia e dopo accurate ricerche vengono rintracciati alcuni ragazzi, presenti durante la gara e rientrati a casa con evidenti e sospette ferite. Anche la bicicletta di Gianni è macchiata di sangue, così come i suoi vestiti. La polizia scientifica inizia l analisi del materiale biologico e decide di identificare il colpevole, facendo il profilo del DNA. 3.2 DNA profiling (test del DNA) E una nuova tecnica di genetica molecolare, utilizzata in tutti quei casi in cui è necessario effettuare l identificazione di un individuo. Oltre che nei laboratori di ricerca in genetica molecolare, questa tecnica è usata nei laboratori di medicina legale di tutto il mondo. Il DNA profiling può essere applicato all identificazione di materiale per attribuirne l appartenenza a vittime o sospetti, come succede nei casi di incidenti aerei, delitti, stupri. Il test del DNA può essere applicato anche alla determinazione di relazioni familiari come paternità, nascite conseguenti a stupri o incesti. Un vantaggio di questa tecnica è che essa consente di analizzare il DNA di un individuo, partendo da quantità molto piccole di materiale biologico. E sufficiente una piccola quantità di cellule, come un capello o le tracce di saliva su un bicchiere o su una sigaretta per poter effettuare il test del DNA con la PCR. Il test del DNA si basa sull analisi dei microsatelliti (vedi 1.6.2), dopo estrazione del DNA dal campione in esame, amplificazione delle sequenze di DNA relative ai microsatelliti (tramite PCR) ed elettroforesi. Se l individuo è omozigote per il locus analizzato (sui due cromosomi omologhi è presente lo stesso numero di ripetizioni), sul gel si osserverà una sola banda, il cui peso molecolare corrisponde alla lunghezza della ripetizione. Se invece l individuo è eterozigote (sui due cromosomi omologhi il numero di ripetizioni è diverso), sul gel si osserveranno due bande di diverso peso molecolare a seconda della lunghezza della ripetizione. Fig. Schema di elettroforesi su gel di due microsatelliti situati su cromosomi omologhi materni e paterni (omozigoti per il locus analizzato) e del figlio (che sarà eterozigote per lo stesso lucus). 11

12 3.3 Schema dei microsatelliti utilizzati Sono stati analizzati i tre seguenti marcatori microsatelliti: i microsatelliti 1, 2 e 3, localizzati su tre cromosomi diversi. 12

13 3.3.1 Esercizi Prima di andare avanti, svolgere i seguenti esercizi. Nota per l insegnante: gli esercizi dal numero 2 al numero 8 cercano di familiarizzare lo studente con l importanza che i marcatori microsatelliti siano altamente polimorfici, vale a dire esista per ogni marcatore un numero elevato di alleli. Però attenzione: ricordare allo studente che, anche se per un dato marcatore esistono molti alleli, un individuo ne porta sempre e solo due, perché è diploide! 1. Si consideri un marcatore del DNA, di cui esistono due alleli (allele 1 e allele 2). Rispondere alle seguenti domande. a) Quanti sono i genotipi omozigoti e quali? Numero di genotipi omozigoti: Genotipo: b) Quanti sono i genotipi eterozigoti e quali? Numero di genotipi eterozigoti: Genotipo: Risposta domanda a: i genotipi omozigoti sono 2 e precisamente: 1, 1 e 2, 2. domanda b: vi è 1 solo genotipo eterozigote e precisamente: 1, 2. Nota per l insegnante: sottolineare allo studente che se il numero di alleli è piccolo, come in questo esempio, il numero di genotipi possibili è piccolo. 2. Relativamente ai marcatori microsatelliti 1, 2, 3, sulla base dello schema riportato nella sezione 3.3, scrivere il peso molecolare degli alleli di ciascuno dei tre microsatelliti. Microsatellite 1 Microsatellite 2 Microsatellite 3 allele 1 allele 13 allele 2 allele 14 allele 3 allele 15 allele 4 allele 16 allele 5 allele 17 allele 6 allele 18 allele 7 allele 19 allele 8 allele 20 allele 9 allele 21 allele 10 allele 22 allele 11 allele 23 allele 12 allele 24 allele 1 allele 2 allele 3 allele 4 allele 5 allele 6 allele 7 allele 8 allele 9 allele 10 allele 11 allele 12 allele 13 allele 14 allele 15 allele 16 Risposta Microsatellite 1 Microsatellite 2 Microsatellite 3 allele 1: 414 allele 13: 450 allele 2: 417 allele 14: 453 allele 3: 420 allele 15: 456 allele 4: 423 allele 16: 459 allele 5: 426 allele 17: 462 allele 6: 429 allele 18: 465 allele 7: 432 allele 19: 468 allele 8: 435 allele 20: 471 allele 9: 438 allele 21: 474 allele 10: 441 allele 22: 477 allele 11: 444 allele 23: 480 allele 12: 447 allele 24: 483 allele 1: 224 allele 2: 228 allele 3: 232 allele 4: 236 allele 5: 240 allele 6: 244 allele 7: 248 allele 8: 252 allele 9: 256 allele 10: 260 allele 11: 264 allele 12: 268 allele 13: 272 allele 14: 276 allele 15: 280 allele 16: 284 allele 1 allele 12 allele 2 allele 13 allele 3 allele 14 allele 4 allele 15 allele 5 allele 16 allele 6 allele 17 allele 7 allele 18 allele 8 allele 19 allele 9 allele 20 allele 10 allele 21 allele 11 allele 1: 102 allele 12: 146 allele 2: 106 allele 13: 150 allele 3: 110 allele 14: 154 allele 4: 114 allele 15: 158 allele 5: 118 allele 16: 162 allele 6: 122 allele 17: 166 allele 7: 126 allele 18: 170 allele 8: 130 allele 19: 174 allele 9: 134 allele 20: 178 allele 10: 138 allele 21: 182 allele 11:

14 3. Relativamente ai marcatori microsatelliti 1, 2, 3, sulla base dello schema riportato nella sezione 3.3, quanti sono i genotipi omozigoti e quali? Microsatellite 1 Microsatellite 2 Microsatellite 3 N. genotipi omozigoti: Genotipi: N. genotipi omozigoti: Genotipi: N. genotipi omozigoti: Genotipi: Risposta Microsatellite 1 Microsatellite 2 Microsatellite 3 N. genotipi omozigoti: 24 N. genotipi omozigoti: 16 N. genotipi omozigoti: 21 Genotipi: 414,414; 417,417; 420,420; Genotipi: 224,224; 228,228; 232,232; 236,236; Genotipi: 102,102; 106,106; 110,110; 423,423; 426,426; 429,429; 432,432; 240,240; 244,244; 248,248; 252,252; 256,256; 114,114; 118,118; 122,122; 126,126; 435,435; 438,438; 441,441; 444,444; 260,260; 264,264; 268,268; 272,272; 276,276; 130,130; 134,134; 138,138; 142,142; 447,447; 450,450; 453,453; 456,456; 280,280; 284, ,146; 150,150; 154,154; 158,158; 459,459; 462,462; 465,465; 471,471; 162,162; 166,166; 170,170; 174,174; 474,474; 477,477; 480,480; 483,483; 178,178; 182,182 4.Relativamente al marcatore microsatellite 1 sulla base dello schema riportato nella sezione 3.3, indicare almeno 5 possibili genotipi eterozigoti. Identificare gli alleli in base al numero di ripetizioni (ad es, 5,9; vedi 1.8). Genotipo eterozigote 1 Genotipo eterozigote 2 Genotipo eterozigote 3 Genotipo eterozigote 4 Genotipo eterozigote 5 Risposta: per scrivere un genotipo eterozigote, bisogna abbinare un allele con un determinato peso molecolare, ossia con un dato numero di ripetizioni, con un altro allele di peso molecolare diverso dello stesso microsatellite, ad esempio 7,12 oppure 4,5. 5. Scrivere un possibile genotipo di un individuo eterozigote per tutti e tre i marcatori microsatelliti analizzati. Identificare gli alleli in base al numero di ripetizioni (ad es. 5, 9; vedi 1.8). Risposta: marcatore microsatellite 1: due alleli diversi, ad esempio 2,9 marcatore microsatellite 2: due alleli diversi, ad esempio 4,16 marcatore microsatellite 3: due alleli diversi, ad esempio 8,15 6. Scrivere un possibile genotipo di un individuo omozigote per il marcatore microsatellite 1 ed eterozigote per i marcatori microsatelliti 2 e 3. Identificare gli alleli in base al numero di ripetizioni (ad es. 5, 9; vedi 1.8). Risposta: marcatore microsatellite 1: due alleli uguali, ad esempio 3,3 marcatore microsatellite 2: due alleli diversi, ad esempio 5,10 marcatore microsatellite 3: due alleli diversi, ad esempio 1,9 7. Si consideri l individuo il cui genotipo è stato scritto nel problema 6, ossia un individuo omozigote per il microsatellite 1 ed eterozigote per i microsatelliti 2 e 3. Si supponga di aver prelevato un campione di cellule da questo individuo, ad esempio un prelievo di sangue, di aver estratto il DNA, di aver tipizzato questo individuo mediante PCR per i microsatelliti 1, 2 e 3 e di aver fatto migrare i prodotti di PCR su gel di agarosio. Disegnare che tipo di bande di DNA ci si aspetta di osservare sul gel e in che posizione, rispetto ad un marcatore di peso molecolare. 14

15 risposta 8. Si considerino tre individui, A, B e C. Relativamente al marcatore 1, si supponga che l individuo A sia omozigote per l allele 6, l individuo B eterozigote per gli alleli 10 e 15 e l individuo C omozigote per l allele 11. Relativamente al marcatore 2, si supponga che l individuo A sia eterozigote per gli alleli 3, 8, l individuo B eterozigote per gli alleli 1 e 12 e l individuo C omozigote per l allele 4. Relativamente al marcatore 3, si supponga che l individuo A sia omozigote per l allele 9, l individuo B eterozigote per gli alleli 10 e 12 e l individuo C eterozigote per gli alleli 16 e 21. Disegnare le bande di DNA che ci si aspetta di osservare sul gel e in che posizione, rispetto ad un marcatore di peso molecolare. risposta 15

16 3.4 Schema dell esperimento V SC S1; S2; S3 I sospetti Il campione di materiale biologico di Gianni è indicato con V= vittima Il campione prelevato sulla scena del crimine è il sangue ritrovato sulla bicicletta ed è indicato con la lettera SC I campioni prelevati dai sospettati sono indicati con: S1, S2, S3 V SC S1 S2 S3 Dai campioni viene estratto il DNA, viene poi applicata la tecnica della PCR, utilizzando coppie di primer specifiche per i tre diversi microsatelliti; successivamente si effettua l elettroforesi e si analizzano i risultati. 3.5 Protocollo sperimentale principali unità di misura usate in biologia cellulare e molecolare a) alcuni prefissi comuni Prefisso Simbolo chilo centi milli micro nano pico femto atto k c m µ n p f a Multiplo o sottomultiplo Esempio 1 kg è grammi 1 cm è 0.01 di un metro 1 ml è 10-3 di un litro 1 µm è 10-6 di un metro 1 ng è 10-9 di un grammo 1 pg è di un grammo 1 fg è di un grammo 1 ag è di un grammo b) unità di volume Nell esperimento che effettueremo, useremo per il DNA volumi molto piccoli, pari a circa 10 µl e per il tampone volumi maggiori, pari a circa ml. Quantità litro millilitro microlitro Abbreviazione l ml µl 16 Equivalente 10-3 l (1 ml = 1 cm3 = 1 cc) 10-6 l (1 µl = 1 mm3)

17 Soluzioni e reagenti tampone TBE (Tris-Borato-EDTA) 1x. Questo tampone si prepara facendo una diluizione 1:10 della soluzione madre TBE 10x, la cui composizione è: Tris 108 gr (0,89 M) acido borico 55 gr (0,89 M) EDTA 9.3 gr (0,02 M) ph 8,3 H 2 O a 1 litro. Il ph 8,3 viene raggiunto automaticamente. DNA prodotti con la PCR, già pronti marcatore di peso molecolare (DNA del plasmide puc8 tagliato con l enzima di restrizione HaeIII) agarosio in polvere (0.6 gr) soluzione EuroSafe (1 µg/ml) loading dye 6x, già pronto in eppendorf e contenente: alcool etilico denaturato e H 2 O distillata Preparazione del gel di agarosio Nota di laboratorio: la concentrazione di agarosio del gel viene scelta dal ricercatore in base alle dimensioni dei frammenti di DNA da separare. Nel nostro caso, dovendo separare frammenti lineari di DNA compresi tra 100 e bp (base pairs, coppie di basi), si utilizza un gel di agarosio al 2%. Operazioni preliminari per chi ha i capelli lunghi: legarsi i capelli con un elastico prima di cominciare a lavorare, lavarsi le mani pulire il banco di lavoro con alcol etilico denaturato prima di cominciare l esperimento, lo studente verrà familiarizzato con la strumentazione che dovrà utilizzare, in modo particolare con le micropipette Preparazione del gel preparare la vaschetta per elettroforesi con bordi di nastro adesivo di carta verificare che il piano su cui si appoggia la vaschetta per elettroforesi sia a bolla misurare 30 ml di tampone TBE 1x in un cilindro e versarli nella beuta di vetro pirex che contiene già 0,6 gr di agarosio. Attenzione a non rovesciare la beuta. L agarosio costa 600 euro al chilo! pesare la beuta contenente la soluzione di agarosio e segnare il peso sul protocollo: leggere attentemente la Nota di sicurezza sulla utilizzazione del forno a microonde sciogliere l agarosio nel forno a microonde impostato sulla potenza indicata da una figura con tre fiammelle ( circa 500V) per 1 minuto. Aprire poi il forno a microonde, agitare delicatamente la soluzione con una presina, facendo attenzione a non scottarsi. Richiudere il forno a microonde e sciogliere la soluzione per un ulteriore minuto alla stessa potenza pesare la soluzione di agarosio (l acqua del tampone, bollendo, è evaporata!) e riportare la soluzione di agarosio al peso originale, utilizzando una spruzzetta con H 2 O distillata. Attenzione: far cadere l acqua delicatamente, facendola scivolare lungo i bordi della beuta, altrimenti si formano delle bolle Aggiungere 1 µl di Eurosafe aspettare 3-5 minuti, coprendo la beuta contenente la soluzione di agarosio con un pezzetto di stagnola, per evitare l evaporazione. L agarosio deve raggiungere una temperatura intorno ai 60 C, altrimenti rovina il supporto di plastica della vaschetta dell elettroforesi. Quindi versare la soluzione di agarosio, evitando di formare bolle, nella vaschetta per elettroforesi dove è già stato inserito il pettine, nella quale va inserito il pettine. I pozzetti si formano quando, una volta solidificato il gel, viene tolto il pettine lasciare solidificare a temperatura ambiente per circa 15 min. Quando è solidificato, il gel diventa opaco mentre si aspetta che il gel solidifica, fare delle prove di caricamento dei pozzetti del gel (12µl di loading dye 1x) su altri gel già pronti togliere il nastro di carta dalla vaschetta e metterla nella cella versare il tampone TBE 1x nella camera di corsa (servono circa 250 ml), evitando che si formino bolle, fino a coprire completamente il gel. Se si formano bolle, toglierle con la punta di una pipetta Pasteur togliere lentamente il pettine, tenendosi perpendicolare rispetto al gel 17 blu di bromofenolo 0.25% xilene cianolo 0.25% glicerolo 30%

18 Corsa elettroforetica scrivere su ciascuna eppendorf con un pennarello waterproof il tipo di campione che vi verrà trasferito: V = vittima; SC = scena del crimine; S1 = sospettato 1; S2 = sospettato 2; S3= sospettato 3; PM = marcatore di peso molecolare prelevare 10 µl di ciascun campione di DNA e trasferirli nella eppendorf corrispondente aggiungere 2 µl di loading dye 6x e risospendere con la micropipetta, evitando di formare bolle. Il glicerolo presente nel loading dye serve per rendere più densa la soluzione di DNA da caricare nel pozzetto e quindi a facilitarne l entrata nel pozzetto se si formano bolle, centrifugare brevemente (1 sec) in una microcentrifuga eppendorf (in gergo di laboratorio, si dice spinnare da spin, centrifugare) leggere attentemente la Nota di sicurezza sulla utilizzazione della centrifuga posizionare la vaschetta per l elettroforesi su un foglio nero, perchè sia più facile individuare i pozzetti caricare lentamente ciascun campione (12 µl) nei singoli pozzetti (ogni pozzetto ha un volume di circa 15 µl), ponendosi con la punta della micropipetta in un angolo del pozzetto e perpendicolare rispetto al gel, facendo attenzione a non bucare il fondo del pozzetto stesso e a non far uscire il campione fuori dal pozzetto in un pozzetto laterale, caricare il marker di DNA a peso molecolare noto chiudere il coperchio della cella elettroforetica leggere attentemente la Nota di sicurezza sulla utilizzazione dell apparato per elettroforesi collegare i morsetti alla camera di corsa e ai poli del generatore di corrente, detto anche power supply; il DNA è carico negativamente e migra verso il polo positivo fissare il voltaggio al valore costante di 100 V e lasciare procedere la corsa elettroforetica per circa 50 min fare attenzione che la banda del blu di bromofenolo non esca dal gel (altrimenti alcune bande di DNA possono uscire dal gel) osservare la migrazione del loading dye per valutare la migrazione del DNA, che, essendo incolore, non si può vedere. Il blu di bromofenolo migra alla stessa velocità di un frammento di DNA a doppia elica di circa 300 bp, mentre lo xilen cianolo migra alla stessa velocità di un frammento di circa bp. Attenzione: fermare la corsa elettroforetica quando il blu di bromofenolo si trova a circa 1-2 cm dalla fine del gel, in modo da evitare che il DNA esca dal gel stesso. Se dovesse succedere, si perdono i campioni di DNA! Operazioni da svolgere alla fine della corsa elettroforetica. al termine della corsa, indossare i guanti monouso disposable, togliere delicatamente il gel dalla cella elettroforetica fare un risciacquo del gel per togliere l eccesso di colorante, trasferendo il gel in un altra vaschetta contenente 300 ml d acqua a temperatura ambiente (va bene l acqua di rubinetto) osservare il gel al transilluminatore documentare il risultato del gel, facendo una foto al gel (ricordarsi di portare una macchina fotografica digitale!) il tampone da elettroforesi TBE (Tris/Borato/EDTA) può essere riutilizzato diverse volte. Recuperate il tampone usato e versatelo in una bottiglia con un imbuto pulire le apparecchiature ed il banco di lavoro con acqua ed etanolo denaturato dopo aver finito di lavorare, lavarsi le mani 18

19 Nota di sicurezza Utilizzazione del forno a microonde non accendere il forno se è vuoto non utilizzare il forno con materiali infiammabili non utilizzare il forno con recipienti sigillati (potrebbero esplodere): svitare i tappi delle bottiglie, rimuovere i coperchi non utilizzare il forno con oggetti metallici o metallizzati: (es. bottiglie coperte di stagnola) e con carta d argento non riempire eccessivamente i recipienti: il liquido bollendo, potrebbe traboccare proporzionare la potenza e il tempo di riscaldamento al contenuto in acqua di quanto viene riscaldato. In particolare, nel caso di soluzioni acquose, il liquido potrebbe surriscaldarsi oltre il punto di ebollizione, senza che appaiano bollicine. Ciò può portare al traboccamento improvviso di liquido bollente. Per prevenire questo pericolo, mescolare il liquido prima di scaldarlo e lasciarlo riposare per qualche minuto prima di togliere il recipiente dal forno utilizzare i guanti imbottiti per togliere i recipienti dal forno dopo l uso pulire il forno con carta spruzzata con detersivo per vetri in caso di incendio del contenuto del forno, tenere chiusa la porta, spegnere il forno, staccare la spina dalla presa di corrente lasciando che il fuoco si estingua per soffocamento Nota di sicurezza Utilizzazione dell apparecchiatura per elettroforesi assicurarsi che l alimentatore sia spento, prima di collegare i morsetti assicurarsi che il coperchio della vaschetta sia correttamente posizionato, prima di collegare i morsetti prima di rimuovere il coperchio della cella elettroforetica, spegnere l alimentatore e staccare i morsetti Nota di sicurezza Utilizzazione della centrifuga chiudere accuratamente il tappo delle provette, per evitare la fuoriuscita di liquido e la formazione di aerosol assicurarsi che il rotore sia bilanciato: provette di ugual peso devono essere inserite negli alloggiamenti diametralmente opposti chiudere il coperchio della centrifuga prima di avviarla non cercare di aprire il coperchio prima del completo arresto del rotore. In caso di fuoriuscita dei liquidi dalle provette, avvertire il personale docente Nota di sicurezza Smaltimento dei rifiuti tutto il materiale monouso (puntali, provette, pipette ecc.) va messo in appositi contenitori per rifiuti cercare di ridurre al minimo il materiale da eliminare, visto i costi elevati del loro smaltimento 19

20 3.5.6 marcatore di peso molecolare di DNA utilizzato Come marcatore di peso molecolare è stato utilizzato il plasmide puc8. Si tratta di una molecola di DNA a doppia elica, con struttura circolare, formata da circa bp. Questo plasmide deriva, per successive modificazioni in laboratorio, da molecole di DNA normalmente presenti nei batteri. Come in tutte le molecole di DNA, nella sequenza nucleotidica di questo plasmide sono presenti i cosiddetti siti di restrizione, ossia delle particolari sequenze di basi (come GAATTC oppure GGCC), in corrispondenza delle quali particolari enzimi, detti enzimi di restrizione, tagliano la molecola di DNA. E un pò come tagliare un cerchio di corda (il DNA plasmidico) con delle forbici (gli enzimi di restrizione) in punti specifici (i siti di restrizione). Se si conosce il peso molecolare del plasmide, ossia la sua lunghezza in coppie di basi, e la posizione dei siti di restrizione di un dato enzina di restrizione, tagliando a pezzetti una molecola circolare si formano frammenti lineari di DNA a peso molecolare noto. Questi costituiscono il marcatore di DNA a peso molecolare noto. Nel nostro caso, il marcatore di peso molecolare è costituito dal plasmide puc8, tagliato con l enzima di restrizione HaeIII. 3.5 Risultati Il risultato del gel di agarosio è riportato nello schema sottostante. 20

21 3.7 Interpretazione La foto del gel va osservata attentamente per stabilire quale indiziato ha lo stesso profilo del DNA di quello prelevato dalla scena del crimine. Per avere la certezza è necessario che le bande dell indiziato coincidano tutte perfettamente con quelle del campione trovato, ossia presentino lo stesso profilo di DNA. Nel nostro caso questo accade per l indiziato 2. Attenzione: in genetica, una rondine non fa primavera, ma neanche due! In altri termini, per poter fare il profilo di un individuo ed ottenere risultati attendibili, bisogna analizzare secondo l FBI almeno 13 microsatelliti. Nel nostro esperimento, abbiamo analizzato 3 microsatelliti e non 13, per motivi di tempo, di spazio e di costi domande di riepilogo Analizzare attentamente il risultato e rispondere alle seguenti domande. 1. Determinare il n di ripetizioni degli alleli dei tre microsatelliti analizzati, tenendo presente lo schema dei microsatelliti riportato nella sezione 3.3. Microsatellite 1 Microsatellite 2 Microsatellite 3 Allele (peso mol.) N ripetizioni Allele (peso mol.) N ripetizioni Allele (peso mol.) N ripetizioni Risposta Microsatellite 1 Microsatellite 2 Microsatellite 3 Allele (peso mol.) N ripetizioni Allele (peso mol.) N ripetizioni Allele (peso mol.) N ripetizioni Determinare il genotipo degli individui relativo a ciascuno dei microsatelliti analizzati, compilando la tabella sottostante. Identificare gli alleli in base al numero di ripetizioni (ad es. 5, 9; vedi 1.8). Microsatellite 1 Microsatellite 2 Microsatellite 3 V SC S1 S2 S3 Risposta V SC S1 S2 S3 Microsatellite 1 1,18 7,24 1,24 7,24 1,18 Microsatellite 2 1,16 16,16 16,16 16,16 6,13 Microsatellite 3 1,14 1,21 7,14 1,21 7,21 3. Quale dei tre microsatelliti non è risultato utile per l identificazione personale e perché? Risposta Il microsatellite 2, perchè alcuni individui (S1 e S2) sono risultati omozigoti. Come pure omozigote è risultato anche il DNA del campione SC. Se gli individui sono omozigoti, ossia presentano in omozigosi lo stesso allele, non è possibile distinguerli. 21

22 4. Norme generali di sicurezza in laboratorio Qui di seguito sono elencate alcune norme elementari di sicurezza, che devono essere tassativamente rispettate. Entrando in laboratorio, individuare le vie di fuga, indicate dalla segnaletica verde. In laboratorio indossare sempre il camice. Il camice deve essere chiuso sul davanti, con maniche lunghe e polsini ad elastico. Al termine delle attività, prima di lasciare il laboratorio, togliersi il camice. In ogni caso, non uscire dal laboratorio, per recarsi in altre aree (biblioteca, uffici, bar, ecc.), senza aver prima tolto il camice. Non introdurre in laboratorio borse, zaini o altro materiale non necessario. Indossare guanti monouso durante la manipolazione di sangue o di materiale da esso derivato non fissato. I guanti devono essere rimossi con attenzione e sostituiti quando sono visibilmente contaminati. I guanti si sfilano rovesciandoli e vanno gettati negli appositi contenitori. Gli studenti che presentano dermatiti o altre lesioni sulle mani, devono indossare guanti protettivi in tutte le fasi di lavoro. I guanti vanno tolti, quando si usino strumenti di qualsiasi natura (telefono, tastiera, strumenti scientifici, maniglie, ecc.). I guanti usati non vanno riutilizzati. Lavare le mani routinariamente, immediatamente dopo la manipolazione di materiali contaminati e, in ogni caso, dopo la fine delle attività, anche quando sono stati indossati i guanti. Lavare sempre le mani prima di lasciare il laboratorio. In laboratorio è vietato mangiare, bere, fumare, portare oggetti alla bocca ed applicare cosmetici. Non pipettare mai con la bocca, ma utilizzare le apposite propipette. Non appoggiare recipienti contenenti liquidi biologici vicino al bordo del banco di lavoro. Tutto il materiale biologico d'origine umana (sangue, ecc.) deve essere considerato come potenzialmente infetto e pertanto trattato con le necessarie precauzioni. Segnalare immediatamente al personale docente ogni spargimento di materiale biologico (ad es. schizzi di sangue) sul piano di lavoro, affinché si provveda alla decontaminazione con un germicida chimico appropriato (candeggina, ecc.). Decontaminare e pulire sempre, al termine del loro utilizzo, le apparecchiature scientifiche e, al termine della attività, i piani di lavoro. Seguire scrupolosamente le indicazioni di sicurezza riportate nei protocolli di esperimento. Raccogliere tutti i liquidi biologici (sangue, terreni di coltura venuti a contatto con le cellule, cellule, ecc.) in speciali contenitori per rifiuti, che verranno successivamente eliminati previo trattamento con candeggina al 15%. Mettere il materiale disposable (pipette, fiasche ecc.) venuto a contatto con materiale biologico in un sacco apposito, che verrà smaltito mediante incenerimento. Stante i costi elevati dello smaltimento, ridurre il più possibile l uso del materiale disposable. Segnalare immediatamente al personale docente qualsiasi incidente o la mancanza di materiale di protezione 22

23 5. Quiz di autovalutazione 1. Completa il brano, scegliendo tra i seguenti termini: somatiche, diploidi, aploidi, poliploidi, germinali, embrione, spora, sessuali, mitosi, meiosi, gameti, cellula uovo, spermatozoo, zigote, aneuploidi, fecondazione. Nella maggior parte degli esseri viventi, uomo compreso, le cellule del corpo, ossia le cellule, hanno un corredo cromosomico doppio e perciò sono dette cellule.. Mediante il processo di, alcune cellule cellule, dette.danno origine a cellule riproduttive o Queste cellule si chiamano. e, rispettivamente nel maschio e nella femmina. Queste cellule si fondono durante il processo della.. e danno origine alla prima cellula del nuovo organismo, detta. 2. Il DNA dell uomo è diverso da individuo a individuo, eccetto che nel caso di: A. marito e moglie B. fratello e sorella C. genitori e figli D. gemelli dizigotici E. gemelli monozigotici 3. Questo disegno rappresenta un nucleotide. Definisci le parti A, B e C: A. B C. 4. Le due emieliche di una molecola di DNA sono antiparallele. Questa affermazione significa che: A. una emielica ha la direzione 5 P 3 OH e l altra 3 OH 5 P B. i legami chimici che tengono uniti i nucleotidi in ciascuna emielica sono diversi C. le due emieliche sono complementari D. una sola delle due emieliche viene trascritta E. la replicazione del DNA è semiconservativa 5. Indicare il corretto ordine decrescente di dimensioni: A. gene, cromosoma, nucleotide, codone B. cromosoma, gene, codone, nucleotide C. nucleotide, cromosoma, gene, codone D. cromosoma, nucleotide, gene, codone E. gene, cromosoma, codone, nucleotide 6. Gli istoni sono: A. tratti di DNA specifici per l attacco della polimerasi B. proteine basiche utilizzate come marcatori nell elettroforesi C. proteine basiche coinvolte nella spiralizzazione del DNA nei cromosomi D. sequenze di DNA codificante particolari proteine E. sequenze ripetute di DNA, che determinano polimorfismo allelico 7. La denaturazione del DNA consiste nella distruzione: A. dei legami tra nucleotidi adiacenti B. dei legami tra zuccheroo e base azotata dei nucleotidi C. della struttura a doppia elica D. della sequenza nucleotidica della doppia elica E. nessuna delle precedenti 23

24 8. In un organismo che produce gameti contenenti 32 cromosomi, il numero dei cromosomi contenuti in una cellula somatica è: A. 16 B. 32 C. 4 D. 64 E Al microscopio ottico è possibile osservare: A. virus B. ribosomi C. proteine D. batteri E. molecole inorganiche 10. Definite i seguenti termini: gene locus 11. In questo diagramma del processo di replicazione del DNA, i quadratini neri contrassegnati da D ed E sono: A. RNA iniziatore (primer) B. DNA filamento stampo (template strand) C. frammenti di Okazaki D. DNA polimerasi E. filamento di DNA di nuova sintesi 12. La replicazione del DNA: (Identificare l affermazione sbagliata) A. è catalizzata dall enzima DNA polimerasi B. avviene in modo simile in tutte le cellule di tutti gli organismi C. richiede l intervento di numerosi enzimi D. necessita della presenza di un innesco a RNA E. avviene mediante aggiunta di nucleotidi in direzione 3' 5' 13. La replicazione semiconservativa del DNA assicura che siano prodotte: A. due molecole identiche di DNA, ognuna formata da una emielica già esistente e da una emielica neo-formata B. molte molecole di RNA, delle quali solo alcune maturano a RNA messaggeri C. quattro molecole di DNA, delle quali solo due vengono conservate D. due emieliche identiche di DNA, ognuna complementare al DNA stampo E. una sola emielica di DNA, copiando uno solo dei due filamenti stampo di DNA 24

25 14. Una molecola di DNA è formata da un filamento che in un certo tratto è costituito dalla seguente sequenza nucleotidica: 5 ATCCATTGTGTCAATT 3. Scrivi quella del filamento complementare, indicandone la polarità. 15. La Taq polimerasi è: A. un enzima che interviene nella replicazione del DNA B. un enzima estratto da un batterio termofilo, usato nelle reazioni della PCR C. il colorante che permette di visualizzare le bande di DNA nell elettroforesi D. l enzima che favorisce l annealing dei primer nei termociclatori E. un marcatore di peso molecolare usato nell elettroforesi 16. Gli enzimi di restrizione: A. separano la doppia elica di DNA nei due singoli filamenti B. copiano una porzione ristretta di DNA C. introducono geni estranei nel DNA D. tagliano il DNA a livello di sequenze nucleotidiche specifiche E. eliminano tratti di DNA 17. Quale delle seguenti affermazioni riguardo all elettroforesi del DNA su gel di agarosio è corretta? A. l elettroforesi su gel separa le singole basi azotate del DNA B. nel corso dell elettroforesi su gel i frammenti di DNA migrano verso l elettrodo positivo a causa della loro carica negativa C. i frammenti più grandi di DNA copriranno, nello stesso tempo, distanze maggiori nel gel rispetto ai frammenti più piccoli D. questa tecnica è usata per amplificare il DNA E. é una tecnica che permette di tagliare il DNA in frammenti 18. Effettuando l elettroforesi del DNA spiegate: a - quale carica assume il DNA e a cosa è dovuta b - il verso di migrazione 19. L acronimo PCR sta per: 20. La tecnica della PCR consiste di vari cicli di amplificazione della sequenza bersaglio di DNA. Ogni ciclo di amplificazione, a sua volta, è costituito da tre fasi. Indicare quali. fase 1: fase 2: fase 3: 21. I primer utilizzati nella PCR: A. sono sequenze ripetute di DNA B. sono oligonucleotidi ritagliati dagli enzimi di restrizione C. per essere utilizzabili devono essere presenti molte volte nel filamento di DNA D. sono corte sequenze nucleotodiche artificiali complementari al DNA da amplificare E. costituiscono i marcatori di peso molecolare usati come riferimento nell elettroforesi 22. I markers di peso molecolare usati nell elettroforesi per individuare la lunghezza dei frammenti di DNA sono miscele di: A. molecole proteiche, a peso molecolare noto, che vengono fatte migrare nella cella elettroforetica insieme ai campioni da analizzare B. molecole di DNA, a peso molecolare noto, che vengono fatte migrare nella cella elettroforetica insieme ai campioni da analizzare 25