VIROLOGIA AMBIENTALE:
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- Sara Ricciardi
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1 VIROLOGIA : ESPERIENZA DELL AGENZIA PER LA PROTEZIONE DELLE MARCHE Dott.ssa Patrizia Ammazzalorso - ARPAM Direzione Generale Dott.ssa Manuela Ercolessi - ARPAM Dipartimento Provinciale di Pesaro Dott.ssa Silvia Magi - ARPAM Dipartimento Provinciale di Pesaro
2 Agenzia Regionale per la Protezione Ambientale delle Marche Sede Centrale via Caduti del Lavoro n ANCONA Istituita con: Legge Regionale n.6 del 2 settembre 1997 Operativa da: 18 ottobre 1999 (nomina del Direttore Generale da parte del Presidente della Giunta Regione Marche)
3 Se rvizi Territoriali
4 Nell ambito delle attività dell epidemiologia ambientale è stata attivata in ARPA Marche, presso il Dipartimento Provinciale di Pesaro, l Unità Operativa Virologia Ambientale, che opera quale centro di riferimento regionale
5 Vengono effettuate: analisi virologiche in ottemperanza alla normativa vigente (ricerca di Enterovirus in acque potabili, di balneazione, sedimenti) Collaborazioni con Università, I.S.S., ecc.
6 Il Dipartimento ARPAM di Pesaro è abilitato: per la fase di concentrazione dei campioni di acqua (ultrafiltrazione tangenziale) per l isolamento di agenti virali mediante colture cellulari con visualizzazione di ECP per l accertamento e l identificazione definitiva dell isolato, si fa riferimento agli enti di competenza (I.S.S. ed Università)
7 Anni MONITORAGGIO DELLA COMPONENTE VIRALE DELLE ACQUE MARINE ADIBITE ALLA BALNEAZIONE Indagine sulla qualità igienica delle acque costiere condotta in collaborazione con l I.S.S. (Laboratorio di Igiene Ambientale)
8 Anno aree marine : una considerata pulita (foce del fiume Tavollo), l altra sporca (foce del fiume Metauro) Anno 1995 Stazioni caratterizzate da situazioni di contaminazioni periodiche con divieti di balneazione temporanei, stazioni non balneabili e siti che sono balneabili
9
10 Anno 1994 TABELLA 1 Batteri indicatori di contaminazione fecale (coliformi e streptococchi), fagi di Escherichia coli, virus enterici, Pseudomonas aeruginosa, vibrioni, salmonelle e fitoplancton in acque di mare e sedimenti prelevati nella zona costiera Foce Tavollo GIUGNO LUGLIO AGOSTO SETTEMBRE ESAME VIROLOGICO Fagi di Escherichia coli MPN/1 ml MPN/1 g * Enterovirus n/1 L n/15 g* ESAME BATTERIOLOGICO Coliformi totali n/1 ml n/1 g* Coliformi fecali n/1 ml n/1 g* Acqua Sedimento Acqua Sedimento Acqua Sedimento Acqua Sedimento assente assente assente assente assente 3 assente ,2.1 2 Streptococchi fecali n/1 ml n/1 g* Vibrio sp / L /25 g* assenti assenti assenti assenti assenti assenti presenti parahaemolyticus cholerae non,1 presente parahaemolyticus Salmonelle / 25 g* - assenti - assenti - assenti - assenti Pseudomonas aeruginosa n/1 ml n/1 g* 13 sierogruppo PMC ESAME FITOPLANCTON Diatomee cell./l 5, , , , Dinoflagellate cell./l Dinophysis 3, sacculus - 3, , ,
11 Anno 1994 TABELLA 2 Batteri indicatori di contaminazione fecale (coliformi, streptococchi), fagi di Escherichia coli,virus enterici, Pseudomonas aeruginosa, salmonelle, vibrioni, fitoplancton in acque di mare e sedimenti della zona costiera Foce Metauro GIUGNO LUGLIO AGOSTO SETTEMBRE ESAME VIROLOGICO Fagi di Escherichia coli MPN/1 ml MPN/ 1 g* Enterovirus n/1 L n/ 15 g* Acqua Sedimento Acqua Sedimento Acqua Sedimento Acqua Sedimento ESAME BATTERIOLOGICO Coliformi totali 34 1, , , ,8.1 2 n/1 ml n/ 1 g* Coliformi fecali 3, n/1 ml n/ 1 g* 22 Streptococchi fecali , n/1 ml n/ 1 g* Vibrio sp /L /25 g* assenti assenti assenti assenti assenti assenti assenti assenti Salmonelle / 25 g* - assenti - assenti - assenti - assenti Pseudomonas aeruginosa n/1ml n/ 1 g* 15 sierogruppopma - P3 6 sierogruppopmf - P5 ESAME FITOPLANCTON Diatomee cell./l 7, , , , Dinoflagellate cell./l Dinophysis 1, sacculus * l unità di misura espressa in grammi si riferisce ai sedimenti - 7, sacculus - 7, ,
12 Anno 1995 TABELLA 3 - Batteri indicatori di contaminazione fecale (coliformi, streptococchi), fagi di Escherichia coli, virus enterici, Pseudomonas aeruginosa, salmonelle, vibrioni e fitoplancton in acque di mare di un area costiera della provincia di Pesaro STAZIONI Baia Flaminia Canale Genica Porto canale - Fano Sassonia Fosso deiturchi Foce Cesano MESE PRELIEVO Luglio Settembre Luglio Luglio Settembre Luglio Settembre Luglio ESAME VIROLOGICO Fagi di Escherichia coli UFP/1 ml 2, , Enterovirus n/ 1 L pres. - Reovirus pres. - Reovirus pres. - Reovirus pres. - Reovirus ESAME BATTERIOLOGICO Coliformi totali n/1 ml , Coliformi fecali n/1 ml 3, , Streptococchi fecali n/1 ml 1, , Vibrio sp/l presente assenti assenti presente presente presente presente assenti cholerae non,1 cholerae non,1 alginolyticus alginolyticus alginolyticus Salmonelle/L B B assenti typhi-murium assenti brandenburg assenti assenti assenti assenti Pseudomonas aeruginosa n/1 ml ESAME FITOPLANCTON 18 sierogruppo PMA-P6 1 sierogruppo PMA-P sierogruppo PMA-P1 8 sierogruppo PMA-P4 2,6.1 5 Dinoflagellate cell./l 3,8.1 3 < 3,8.1 3 < 3,8.1 3 < 3, , , , Dinophysis 4 - fortii
13 Area costiera Foce Tavollo - Gabicce Acqua di mare prelievo 2 prelievo 3 prelievo 4 prelievo Coliformi totali (n/1 ml) Streptococchi fecali (n/1 ml) Pseudomonas aeruginosa (n/1 ml) Coliformi fecali (n/1 ml) Fagi di Escherichia coli (MPN/1 ml) Fitoplancton totale (cell/l) 1 prelievo 2 prelievo 3 prelievo 4 prelievo Enterovirus (n/1 L) Vibrio sp (/ L) Assenza Presenza
14 Area costiera Foce Tavollo - Gabicce Sedimento prelievo 2 prelievo 3 prelievo 4 prelievo Coliformi totali (n/1 ml) Streptococchi fecali (n/1 ml) Pseudomonas aeruginosa (n/1 ml) Coliformi fecali (n/1 ml) Fagi di Escherichia coli (MPN/1 ml) 1 prelievo 2 prelievo 3 prelievo 4 prelievo Enterovirus (n/1 L) Vibrio sp (/ L) Salmonella (/25 g) Assenza Presenza
15 Area costiera Foce Metauro - Fano Acqua di mare prelievo 2 prelievo 3 prelievo 4 prelievo Coliformi totali (n/1 ml) Streptococchi fecali (n/1 ml) Pseudomonas aeruginosa (n/1 ml) Coliformi fecali (n/1 ml) Fagi di Escherichia coli (MPN/1 ml) Fitoplancton totale (cell/l) 1 prelievo 2 prelievo 3 prelievo 4 prelievo Enterovirus (n/1 L) Vibrio sp (/ L) Assenza Presenza
16 Area costiera Foce Metauro - Fano Sedimento prelievo 2 prelievo 3 prelievo 4 prelievo Coliformi totali (n/1 ml) Streptococchi fecali (n/1 ml) Pseudomonas aeruginosa (n/1 ml) Coliformi fecali (n/1 ml) Fagi di Escherichia coli (MPN/1 ml) 1 prelievo 2 prelievo 3 prelievo 4 prelievo Enterovirus (n/1 L) Vibrio sp (/ L) Salmonella (/25 g) Assenza Presenza
17 Litorale pesarese da Baia Flaminia a Foce Cesano Acqua di mare B. Flaminia* Can.Genica Porto c. Fano* Sassonia Fosso d. Turchi Foce Cesano Coliformi totali (n/1 ml) Coliformi fecali (n/1 ml) Streptococchi fecali (n/1 ml) Fagi di Escherichia coli (UFP/1 ml) Pseudomonas aeruginosa (n/1 ml) Fitoplancton totale (cell/l) 1 prelievo 2 prelievo 3 prelievo 4 prelievo 5 prelievo 6 prelievo Enterovirus (n/1 L) Vibrio sp (/ L) Salmonella (/25 g) Assenza Presenza Reovirus
18 Anno 1997 Collaborazione con l I.S.S. e il Dipartimento di Biomedicina - Sezione di Igiene- Università di Pisa Rilevazione di Reovirus in campioni di acque di mare con l applicazione delle nuove tecniche biomolecolari Il lavoro rientrava nell ambito del progetto: Salute umana- Progetto esecutivo I.S.S.- MURST: salvaguardia del Mar Adriatico.
19 Anno Pesaro foce fiume Foglia Campione di : acqua di mare (DPR 47\82) Analisi n. : 1 28 VRL \ TAL Punto di prelievo: a 2 m. dalla riva Prelevato da: Tecnici SMSP Parametri Coliformi totali ufc\1 ml Coliformi fecali - ufc\1 ml Streptococchi fecali ufc\1 ml 19 Febbr. 18 Marzo 7 Aprile 27 Maggio 1 Giugno 23 Giugno 2 Luglio 21 Luglio 1 Agosto 18 Agosto 1 Sett. 25 Sett. 22 Ottobre < < < < Salmonelle\1 L assenti assenti assenti assenti assenti assenti assenti assenti assenti assenti assenti assenti assenti assenti assenti 1 Dic. 18 Dic. Enterovirus n\1 L (*) (*) il campione ha presentato ECP dopo 4 passaggi ripetuti su monostrato cellulare BGM; viene inviato all Istituto Superiore di Sanità Roma per l identificazione Fano zona Lido Campione di : acqua di mare (DPR 47\82) Analisi n. : 1 28 VRL \ TAL Punto di prelievo: a 2 m. dalla riva Prelevato da: Tecnici SMSP Parametri Coliformi totali ufc\1 ml Coliformi fecali - ufc\1 ml Streptococchi fecali ufc\1 ml 19 Febbr. 18 Marzo 15 Aprile 13 Maggio 5 Giu. 17 Luglio 1 Agosto 24 Agosto 1 Sett. 29 Sett. 22 Ottobre Salmonelle\1 L assenti assenti assenti assenti assenti assenti assenti assenti assenti assenti assenti assenti assenti Enterovirus n\1 L (*) 11 Dic. 18 Dic. (*) il campione ha presentato ECP dopo 4 passaggi ripetuti su monostrato cellulare BGM; viene inviato all Istituto Superiore di Sanità Roma per l identificazione. Gli esami microbiologici sono stati eseguiti secondo le indicazioni del DPR 47\82. Gli esami virologici sono stati eseguiti secondo il protocollo I.S.S. Roma (Rapp.to Istisan 91\26): concentrazione con ultrafiltrazione tangenziale e successivo isolamento evidenziato da comparsa di ECP ( effetto citopatico) indotto su colture cellulari BGM (Buffalo Green Monkey). I campioni inviati all I.S.S. sono stati identificati come Reovirus.
20 Anno 2 Collaborazione con l Istituto di Igiene Università La Sapienza di Roma sulla ricerca: Sorveglianza della circolazione ambientale dei Poliovirus e dello stato immunitario della popolazione italiana Per la Regione Marche: Dipartimento ARPAM di Pesaro contaminazione virale delle acque di superficie Università di Ancona-Istituto di Igiene- parte sieroepidemiologica
21 Analisi virologica di materiali di dragaggio marini per il ripascimento dei litorali (D.M. 24 gennaio 1996) N di campioni analizzati ANNO 22 N 23 campioni Risultati N di campioni analizzati ANNO 23 Nessun Enterovirus isolato in colture di cellule di BGM N 12 campioni Risultati Nessun Enterovirus isolato in colture di cellule di BGM
22 Enterovirus (acqua) n/1l Protocollo operativo ISTISAN: ANALISI VIROLOGICHE Prefiltrazione su membrane di acetato di cellulosa (porosità 8µm): eluizione del prefiltro in beef extract broth al 3% a ph9, agitazione per 3 centrifugazione e neutralizzazione del sovranatante a ph 7,4 con HCl 1 N. Aggiunta dell eluato al campione da concentrare. Concentrazione mediante ultrafiltrazione tangenziale con l utilizzo del sistema Sartocon mini cassette con moduli in polisulfone di taglio molecolare 1. NMWC e.1 m 2 di superficie filtrante, lavati con acqua demonizzata e condizionati con soluzione di estratto di carne al 3% a ph 9 al fine di deadsorbire eventuali particelle virali rimaste adese e la soluzione di lavaggio è stata aggiunta al campione concentrato. Neutralizzazione del concentrato a ph 7,4 e decontaminazione con cloroformio (5%). Isolamento su monostrati di cellule di rene di scimmia (BGM) in terreno liquido(mem con sali di Earle), per il rilevamento dell ECP con l effettuazione di due o tre passaggi di conferma. Identificazione con sieroneutralizzazione.
23 ANALISI VIROLOGICHE Enterovirus (sedimento) n/g s.s. Metodo qualitativo: 5 g di sabbia vengono addizionati a 15 ml di estratto di carne al 3% a ph 9, agitando per 3 e centrifugando a 3 rpm per 3. Il sovranatante viene poi portato a ph 7, decontaminato e infine testato su colture cellulari (BGM).
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