Determinazione dell azoto totale e ammoniacale in spettrofotometria: modalità di calibrazione e confrontabilità nel tempo
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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PAVIA CORSO DI LAUREA INTERFACOLTÀ IN BIOTECNOLOGIE Determinazione dell azoto totale e ammoniacale in spettrofotometria: modalità di calibrazione e confrontabilità nel tempo Relatore: Prof.ssa Anna Occhipinti Correlatori: Dott.ssa Michela Rogora (CNR ISE) P.I. Gabriele Tartari Tesi Sperimentale di Fabrizio Ferrari
2 Obbiettivi del lavoro di tesi Le attività svolte, realizzate presso i laboratori di idrochimica del CNR ISE di Verbania Pallanza, sono state: La procedura completa della calibrazione, dalla preparazione degli standard ai calcoli dei parametri delle rette di taratura, per due metodiche spettrofotometriche: analisi dell azoto ammoniacale (N NH 4 ) e per l azoto totale (NT) in matrici acquose. N NH 4 : proveniente dalla degradazione composti organici e idrolisi dell urea. NT: somma di tutti i composti azotati contenuti in un acqua, comprensiva della componente particellata. Il confronto tra i dati ottenuti e quelli presenti nel database del laboratorio dall anno 2 in poi relativi allo stesso spettrofotometro. Stabilire il migliore approccio da utilizzare nella calibrazione dello strumento grazie all elaborazione dei dati raccolti
3 Principi teorici La legge di Lambert Beer: A = Assorbanza; ε = coefficiente di assorbimento; b = cammino ottico; C = concentrazione La regressione lineare: Relazione fra due variabili che rispondono a una legge di dipendenza del tipo Retta migliore che interpoli una serie di punti sperimentali che consenta di ricavare una relazione lineare fra le due variabili Il modello matematico della regressione lineare ai minimi quadrati consente di minimizzare i quadrati delle distanze fra i punti osservati e la retta stessa (Linee guida ISO, IUPAC, APAT IRSA CNR)
4 Metodi statistici per la verifica della linearità: Il coefficiente di determinazione R 2 ; se si avvicina a 1 c è linearità, quindi la regressione ai minimi quadrati è ideale per descrivere la relazione fra le variabili Il coefficiente di correlazione lineare r; serve a verificare se fra due variabili esiste una correlazione; si formulano delle ipotesi e si verificano con i test t di Student e F di Fisher Intervalli di fiducia della pendenza e dell intercetta: il primo consente di verificare quanto la pendenza sia significativamente diversa da zero, il secondo di verificare se la retta passi per lo zero.
5 Assorbanza 1,6 1,4 1,2 1,8,6,4,2 Metodi grafici per la verifica della linearità Fattore di risposta (RF): il rapporto fra il segnale (assorbanza) e la concentrazione. Valori di RF costanti indicano un ottima correlazione lineare, ma vengono comunque ritenuti validi andamenti di RF contenuti entro l intervallo di ±5% del valore medio. Analisi dei residui: sono le distanze dei punti sperimentali dalla retta di regressione, misurate in concentrazione (µg N L 1 o mg N L 1 ), in direzione parallela all asse di risposta. Per la linearità i punti dovrebbero essere positivi e negativi in ugual numero e quindi equamente distribuiti intorno allo zero Concentrazione Dati Retta RF RFm+5% RFm 5% RF x 1 3 Assorbanza 1,6 1,4 1,2 Dati 1 Retta,8 RESIDUI,6 Zero,4, Concentrazione,4,3,2,1,1,2,3,4 Residui (mg/l)
6 Metodi Analitici.5 Azoto ammoniacale: Principio: Reazione per la formazione del composto Blu Indofenolo. Massimo di assorbanza alla λ di 695 nm. 695 nm Azoto totale: Principio: ossidazione per convertire anitrato tutte le specie chimiche organiche contenenti azoto. Determinazione diretta alla λ di 22 nm solo su campioni mineralizzati. Assorbanza (u A) Lunghezza d'onda (nm) APAT IRSA CNR, metodo 43 APAT IRSA CNR, metodo 46
7 Intervalli analitici e ripetibilità Passo ottico Intervallo analitico LOD (IUPAC) LOQ (IUPAC) Ammonio (µg N L 1 ) 1 cm Azoto totale (mg N L 1 ) 1 cm,4 6,,5,18 R.S.D. R.S.D Azoto ammoniacale metodo blu indofenolo 695 nm Azoto totale ossidazione autoclave lettura diretta 22 nm µg N L mg N L -1 Dati degli intervalli analitici e ripetibilità ottenuti dal CNR ISE di Verbania
8 Differenza rispetto ai valori attesi (A) Verifica dello spettrofotometro Accuratezza e ripetibilità delle λ nell intervallo nm,3,2,1, -,1 -,2 -,3 Perkin Elmer Lambda 2 SAFAS UV mc2 35 nm 313 nm 257 nm 235 nm Limite Superiore I valori ottenuti sono sempre stati contenuti nei limiti fissati dalla normativa (±,1 A), a conferma della stabilità e confrontabilità nel tempo delle prestazione degli spettrofotometri Limite Inferiore Assorbanza Controllo della linearità fotometrica (Lambert Beer) 3, 2,5 2, 1,5 1,,5, 35 nm, mg L 1 Dati R.F. R.F. teorico La linearità fotometrica arriva fino a circa 1.5 u.a,11,9,7,5 R.F.
9 Preparazione delle soluzioni di calibrazione Azoto ammoniacale Madre A:,73678 g di NH 4 Cl in 1 ml di H 2 O corrispondente a 2 µg N NH 4 ml 1 Madre B: 1 ml della madre A in 1 ml di H 2 O corrispondente a 2 µg N NH 4 ml 1 Azoto totale Madre:,61286 g di NaNO 3 in 1 ml di H 2 O corrispondenti a,1 mg N ml 1 Concentrazione Prelievo Volume finale µg N L 1 madre A madre B ml 1 1 ml ml ml µl µl µl 1 Concentrazione Prelievo Volume finale mg N L 1 ml,4 2 µl 5,8 4 µl 5 1, 5 µl 5 1,5 15 ml 1 2, 2 ml 1 3, 15 ml 5 4, 2 ml 5 5, 25 ml 5 6, 3 ml 5
10 Risultati calibrazione: azoto ammoniacale Data della calibrazione: 29 gennaio 214 Retta di regressione lineare: Assorbanza = a + b x Concentrazione Intercetta a =,22 Pendenza b =,15 Coefficiente correlazione lineare (r),99972 Retta di calibrazione N NH 4 e analisi del fattore di risposta. Retta di calibrazione N NH 4 e analisi dei residui Assorbanza 1,8 1,6 1,4 1,2 1,8,6,4, Concentrazione Dati Retta RF RFm +5% 1,2 1,15 1,1 1,5 1,95,9,85,8 RF x 1 3 Assorbanza 1,8 1,6 1,4 1,2 1,8,6,4,2 Dati Retta RESIDUI ZERO Concentrazione Residui (µg/l)
11 Risultati calibrazione: azoto totale Data della calibrazione: 13 febbraio 214 Retta di regressione lineare: Assorbanza = a + b x Concentrazione Intercetta a =,74 Pendenza b =,2283 Coefficiente correlazione lineare (r),99996 Assorbanza Retta di calibrazione NT e analisi del fattore di risposta 1,6 1,4 1,2 1,8 Dati,6 Retta,4 RF,2 RFm+5% RFm 5% Concentrazione RF x 1 3 Assorbanza Retta di calibrazione NT e analisi dei residui 1,6 1,4 1,2 Dati 1 Retta,8 RESIDUI,6 Zero,4, Concentrazione,4,3,2,1,1,2,3,4 Residui (mg/l)
12 Spettrofotometri utilizzati nel CNR ISE dal 1977 al 214 Periodo di utilizzo Strumento in uso Spettrofotometro Beckman 25 (19 9 nm) Spettrofotometro Perkin Elmer Lambda 1A (19 9 nm) Spettrofotometro Perkin Elmer Lambda 2 (19 11 nm) Spettrofotometro SAFAS UV mc2 (18 15 nm) Spettrofotometro SAFAS UV mc2
13 Confronto con le calibrazioni precedenti Spettrofotometro Azoto ammoniacale 1 cm 695 nm Azoto totale 1 cm 22 nm periodo di utilizzo b 1 3 b r b 1 3 b r Beckaman 25 Media 1,2,99, , 228,8,99985 anni S.D. 3,4,2,2 4,8 2,48,8 R.S.D. 2,4 % 1,1 % Perkin Elmer Media 1,5 1,1,9996 8,2 27,13,99991 Lambda 1A S.D. 9,,3,2 2,1 3,93,9 anni R.S.D 2,8 % 1,9 % Perkin Elmer Media 2,3 1,4, ,6 213,59,99999 Lambda 2 S.D. 2,6,1,3 1,3 2,65, anni R.S.D 1,1 % 1,2 % SAFAS UV mc2 Media 3,6 1,4, , 231,12,99977 anni S.D. 4,1,2,17 4,2 5,48,23 R.S.D 1,6 % 2,4 % Tutto il periodo Media 3,8 1,27, ,2 222,9,99986 anni S.D. 5,2,28,19 4,2 1,7,18 R.S.D. 2,7 % 4,8 %
14 Pendenza delle rette di calibrazione nel periodo ,1E-3 N-NH nm,25 N totale 22 nm 1,1E-3 P.E. Lambda 2,24 SAFAS UV mc 2 Pendenza della retta 1,E-3 1,E-3 1,E-3 9,8E-4 P.E. Lambda 1 SAFAS UV mc 2 Pendenza della retta,23,22 Beckman 25 P.E. Lambda 2 9,6E-4 Beckman 25,21 P.E. Lambda 1 9,4E , La distribuzione delle pendenze dipende dalle diverse prestazioni dello strumento quando lavora a diverse lunghezze d onda. Singolo strumento: prestazioni stabili e confrontabili. Diversi strumenti: piccoli scostamenti sistematici.
15 Calibrazioni con lo spettrofotometro SAFAS UV mc2 nel periodo Elaborazione del data set delle calibrazioni CNR ISE. R.S.D. < 4% per tutti gli standard di calibrazione. Ogni singola calibrazione è confrontabile con lo storico delle calibrazioni precedenti grazie alla bassa variabilità di R.S.D
16 Rette di calibrazione per l azoto ammoniacale e azoto totale con i dati mediani degli standard nel periodo (2 214). Segnale (A) 1,8 1,5 1,2,9,6,3, Cuvetta 1 cm A =,14 µg N L -1 +,42 1,2 1,1 1, (a), Concentrazione azoto ammoniacale (µg N L -1 ) RF 1-3
17 Confronto NT del Lago Maggiore a 2m di profondità con la media delle calibrazioni rispetto alla singola calibrazione 1,1 1,5 NT (mg N L 1 ) Lago Maggiore profondità 2 m Media delle calibrazioni Singola calibrazione Nuova calibrazione 1,,95,9,85,
18 Conclusioni Per verificare la stabilità di tutto il processo analitico si dovrebbe effettuare la calibrazione con frequenza regolare (per esempio annuale) Nella letteratura scientifica (ISO, IUPAC, Standard Methods) non vi sono indicazioni specifiche riguardo alla frequenza di esecuzione o verifica della calibrazione e del confronto con le calibrazioni precedenti L utilizzo di una retta di calibrazione costruita con i valori medi (o mediani) di assorbanza degli standard, ottenuti in un lungo periodo di tempo e con uno stesso strumento, è migliore rispetto all utilizzo esclusivo di una sola retta di calibrazione
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