La regolazione dell espressione genica. Quali sono i meccanismi che determinano l accensione o lo spegnimento dell espressione di un gene?

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1 La regolazione dell espressione genica Quali sono i meccanismi che determinano l accensione o lo spegnimento dell espressione di un gene?

2 La regolazione dell espressione genica Nei procarioti: un espressione genica selettiva permette alle cellule di risparmiare energia La regolazione avviene prevalentemente a livello trascrizionale Negli eucarioti: l espressione genica selettiva permette alle cellule di svolgere ruoli specializzati La regolazione avviene a vari livelli

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4 Regolazione genica nei procarioti Geni costitutivi: sono costantemente attivi (es. geni che codificano per gli enzimi della glicolisi) Geni regolati: la loro espressione è regolata in modo tale che che la quantità del corrispondente prodotto (proteina o RNA) è controllata in relazione al fabbisogno cellulare (es. sintesi adattativa di enzimi)

5 NON TUTTI I GENI VENGONO UTILIZZATI NELLO STESSO MOMENTO E NON TUTTI CON LA STESSA INTENSITÀ Regolazione genica = la modalità con cui viene REGOLATA la tipologia e la quantità dei prodotti genici Prodotto genico = RNA e/o proteina (in ultima analisi)

6 Regolazione Genica nei Procarioti Finalità: Rispondere rapidamente ai cambiamenti ambientali Logica: Risparmiare energia; niente mrna o proteine che non servano subito Base fisiologica: la maggior parte dei geni è espressa costitutivamente pochi geni sono regolati, ognuno con il suo meccanismo individuale, di induzione o di repressione

7 I geni strutturali dei batteri sono organizzati in cluster : gruppi di geni codificanti per proteine con funzioni correlate, (es. enzimi di una stessa via metabolica, proteine deputate al trasporto intracellulare ecc), che si trovano sotto il dominio di un unico promotore.

8 OPERONE Unità di trascrizione descritta nel 1961 da François Jacob e Jacques Monod, che per questo furono insigniti del premio Nobel. L unità completa include: Geni strutturali: codificano per le proteine di interesse Operatore: Sito sul DNA riconosciuto dalla proteina repressore Promotore: Sito sul DNA cui si lega l RNA polimerasi per iniziare la trascrizione dei geni situati a valle

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13 Sono proteine RNA Repressore polimerasi La capacità dell RNA polimerasi di iniziare la trascrizione dipende dall assenza di impedimenti a livello del promotore; possono essere presenti dei repressori che impediscono l inizio della trascrizione. Si parla di regolazione negativa Promotore Operatore Gene 1 Gene 2 Gene 3 Sono sequenze di DNA

14 Il repressore inattivo non si lega all operatore. La RNA polimerasi può eseguire la trascrizione. Repressore Promotore Operatore Gene 1 Gene 2 Gene 3 Proteina 1 Proteina 2 Proteina 3 N.B.: il sito operatore non viene trascritto e non codifica per nessuna proteina

15 Il repressore attivo si lega all operatore. La RNA polimerasi NON può eseguire la trascrizione. Promotore Operatore Gene 1 Gene 2 Gene 3

16 Da dove viene il repressore? La trascrizione dei geni strutturali è spesso controllata dall attività di un altro gene, detto REGOLATORE Il gene regolatore codifica per la proteina repressore, che si lega in maniera specifica all operatore di un operone Il gene regolatore può trovarsi in qualsiasi punto del DNA batterico, non necessariamente adiacente all operone

17 RNA polimerasi Regolatore Promotore Operatore Geni Repressore

18 Facciamo un esempio: Escherichia Coli Per trasformare l ALLOLATTOSIO in glucosio da utilizzare come fonte di energia sono necessari tre enzimi, codificati da tre geni appartenenti allo stesso operone (lac) Per sintetizzare il TRIPTOFANO servono cinque enzimi, codificati da cinque geni appartenenti allo stesso operone (trp)

19 I batteri utilizzano strategie diverse per regolare la sintesi degli enzimi Vie cataboliche e induzione da substrato Vie anaboliche e repressione da prodotto finale Gli enzimi che catalizzano queste vie sono spesso regolati in modo coordinato: la sintesi di tutti gli enzimi coinvolti in una particolare via viene attivata o repressa simultaneamente

20 Operone lac: Induttore Si tratta di una VIA CATABOLICA, normalmente inattiva (non espressa), che viene attivata (INDOTTA) dalla presenza della molecola da degradare (il lattosio) Repressore inattivo

21 OPERONE TRP: Repressore inattivo Si tratta di una VIA ANABOLICA, normalmente attiva (espressa), che viene inattivata o REPRESSA dalla presenza della molecola (il triptofano) che si forma per effetto delle attività enzimatiche. Corepressore + repressore

22 Operone lattosio (lac) Operone triptofano (trp) Geni inducibili Geni reprimibili

23 DOMANDA CHIAVE Cosa permette al repressore di attaccarsi o meno al sito operatore?

24 Effettore E una molecola che si lega in maniera specifica al repressore. Questo legame può rendere attivo o inattivo il repressore.

25 Si lega all operatore Trascrizione impedita Trascrizione impedita Si lega all operatore

26 In base all effetto che il complesso EFFETTORE-REPRESSORE produce sulla trascrizione si possono distinguere: geni inducibili geni reprimibili

27 Caratteristiche comuni ai due processi 1. Il controllo è effettuato a livello genomico 2. Il controllo viene indotto da piccole molecole (effettori) che modificano la conformazione di molecole che controllano l espressione genica Per le vie cataboliche i substrati (lattosio) Per le vie anaboliche i prodotti finali (triptofano)

28 I geni coinvolti nel catabolismo del lattosio sono organizzati in un operone inducibile La delezione del gene lac I origina cellule che producono sempre le tre proteine indipendentemente dalla presenza dell induttore Lac I codifica per un repressore

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30 Gli operoni lac e trp spiegano il controllo negativo della trascrizione Per le vie cataboliche la forma attiva del repressore (che si lega al DNA) è rappresentata dalla proteina repressore libera dall effettore Per le vie anaboliche la forma attiva è quella della proteina repressore legata all effettore che in questo caso può definirsi corepressore In entrambi i casi il risultato è lo stesso: il repressore attivo previene la trascrizione dell operone bloccando il legame della RNA polimerasi al DNA

31 Il repressore lac si lega ai due operatori come tetramero L ansa si forma tra le repressore legato all'operatore principale e quello a monte, ausiliario a 90 bp. Un'ansa del tutto simile si può formare in alternativa con un operatore a valle, a 400 bp

32 Operone del triptofano l'operone triptofano di E.coli codifica per il leader e per geni strutturali che codificano gli enzimi trp

33 La attenuazione Anche con basso Trp molti tradotti terminano prematuramente, prima del gene trpe. Solo la sequenza leader viene tradotta. Essa è seguita da un terminatore Ci sono 4 sequenze complementari nel mrna 1, 2, 3 e 4. Esse si possono appaiare diversamente L RNA ha una ORF di 14 amino acidi, con una forte RBS e che codifica per 2 trp.

34 In condizioni di elevata concentrazione di triptofano la sequenza 3 si appaia con la sequenza 4 costituendo la hairpin di terminazione della traduzione. In condizioni di bassa concentrazione di triptofano il ribosoma si blocca sugli adiacenti codoni per il triptofano permettendo alla sequenza 2 di appaiarsi con la 3 e quindi impedendo la formazione della forcine di terminazione 3 e 4. Quindi la traduzione può continuare In assenza di sintesi proteica poiché il ribosoma non inizia la traduzione della AUG del peptide leader si forma una forcina appaiando le sequenze 1 e 2 e quindi non si forma quella data dalle sequenze 2 e 3 ne consegue che si forma una forcina con le sequenza 3 4 e gli enzimi per trp non sono espressi

35 Differenze della regolazione genica fra procarioti ed eucarioti Dimensione e complessità del genoma Compartimentazione del genoma Organizzazione strutturale del genoma Stabilità dell mrna Modificazione post-traduzionale delle proteine Turnover delle proteine Le cellule eucariotiche sono prive di operoni!

36 Livelli multipli di regolazione dell espressione genica degli eucarioti

37 I meccanismi di controllo usati per regolare l espressione dei geni umani devono essere molto più complessi da quelli utilizzati dagli altri organismi. Regolazione trascrizionale Regolazione post-trascrizionale Meccanismi epigenetici e controllo dell espressione genica a lunga distanza

38 Cellula umana contiene circa geni RNA genes Geni per proteine Ogni cellula in un determinato momento esprime solo una piccola parte di questo potenziale ( 5000 geni) Geni housekeeping metabolismo biosintesi membrana istoni ribosomali Geni tessuto - specifici DIFFERENZIAMENTO CELLULARE A QUESTA ESPRESSIONE SELETTIVA NON CORRISPONDE (IN GENERE) UNA VARIAZIONE DEL CONTENUTO DI DNA

39 Esistono molteplici livelli di regolazione dell espressione genica negli eucarioti NUCLEO controllo trascrizionale: legame di fattori trascrizionali tessuto specifici, legame diretto di ormoni, fattori di crescita o elementi intermedi a elementi risponsivi di geni inducibili DNA Trascritto primario (precursore) Meccanismi epigenetici: controllo a lungo raggio mediante rimodellamento della struttura della cromatina controllo post-trascrizionale: splicing alternativo, polya alternativo, RNA editing tessutospecifico mrna CITOPLASMA controllo traduzionale traduzione mrna controllo del trasporto controllo della stabilità degradazione PROTEINA PROTEINA attiva o inattiva controllo post-traduzionale

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42 CROMATINA EUCROMATINA -> TRASCRIZIONE POTENZIALE a) geni housekeeping b) geni tessuto-specifici ETEROCROMATINA FACOLTATIVA -> inattiva quando condensata. Fornisce un meccanismo di compensazione: rapporto geni autosomici/geni X-linked maschi = 2/1 donne = 1/1 ETEROCROMATINA COSTITUTIVA -> sempre inattiva; Localizzata nelle regioni peri - e centromeriche

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48 Meccanismi epigenetici Fattori che vengono trasmessi alla progenie, ma che non sono direttamente attribuibili alla sequenza del DNA. Metilazione del DNA; Nelle cellule eucariotiche la metilazione è a carico della C. Solo il 3% delle C sono metilate ed in genere è bersaglio della metilazione la C della doppietta CpG. Modificazioni degli istoni; Acetilazioni, fosforilazioni e metilazioni, responsabili di cambiamenti conformazionali della cromatina.

49 Modificazioni epigenetiche: Modificazioni ereditabili che non alterano la sequenza nucleotidica dei geni ma ne alterano l attivita : Acetilazione degli istoni della cromatina Metilazione del DNA

50 Meccanismi epigenetici: Metilazione del DNA La metilazione del DNA è un processo post-replicativo. L estensione delle modificazioni riguardanti la metilazione del DNA è fondamentalmente decisa durante lo sviluppo. La metilazione del DNA è quindi uno dei meccanismi correlati con il differenziamento cellulare, tramite l inibizione dell espressione genica a livello trascrizionale.

51 Metilazione del DNA Human Molecular Genetics 2

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55 Le principali funzioni della metilazione sono collegate alla repressione della trascrizione: Difesa contro i trasposoni: la metilazione e fondamentale per mantenere silenti i genomi dei trasposoni e dei retrotrasposoni Regolazione genica: la metilazione contribuisce a stabilire e mantenere uno stato trascrizionalmente inattivo (eterocromatina)

56 Metilazione e regolazione genica: Dnmt metilano il DNA Il DNA metilato è legato da proteine che legano il metile (MeCP2, MBD1-4) Queste a loro volta sono in grado di reclutare diversi HDAC -> repressione della trascrizione

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58 Modificazioni degli istoni H3 e H4 La lisina 9 di H3 può essere sia acetilata che metilata. L acetilazione è associata alla cromatina trascrizionalmente attiva, ma se la regione cromatinica viene metilata a livello del DNA (CpG), le proteine che si legano al DNA metilato richiamano le deacetilasi istoniche, che rimuovono i gruppi acetile e le metil transferasi istoniche, legate alle CpG binding protein, metilano gli istoni. Il risultato è la condensazione della cromatina.

59 CARATTERISTICHE DELLA CROMATINA Caratteristica Cromatina attiva Cromatina inattiva Conformazione della cromatina Estesa, aperta Condensata Metilazione del DNA Acetilazione degli istoni Poco metilata specialmente nelle regioni del promotore Istoni acetilati Metilata Istoni non acetilati

60 Repressori e attivatori possono dirigere la deacetilazione/acetilazione degli istoni a livello di specifici geni Importanza della struttura modulare e delle interazioni proteina-proteina

61 Una serie di fattori trascrizionali deve legarsi al promotore prima che possa farlo la RNA polimerasi. Quindi se la RNA polimerasi potrà iniziare la trascrizione dipenderà anche dal legame di proteine regolatorie, attivatori e repressori. Elementi distali Elementi prossimali Promotore basale

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68 Il controllo dell espressione genica è intrinsecamente rumoroso

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73 Coda di polia negli oociti

74 Micro RNA (mirna) Piccole molecole di RNA (20-22 nt) Prodotte da precursori di nt trascritti autonomamente (anche policistronici) o maturati da introni Si legano a mrna che hanno sequenze complementari Presenti in tutti gli eucarioti 74

75 mirna mirna lin4 e let7 sono stati scoperti inizialmente nei nematodi sono conservati dai vermi fino all uomo la loro funzione è il controllo della TRADUZIONE di specifici mrna funzionano come MODULATORI

76 Conservazione dei mirna

77 Biogenesi dei microrna I microrna sono molecole, dalla lunghezza di nucleotidi, che regolano l espressione dei geni a livello posttrascrizionale

78 Biogenesi dei mirna nelle piante e negli animali

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82 Funzione dei mirna Controllo della proliferazione cellulare Controllo della apoptosi Differenziamento ematopoietico Controllo dello sviluppo in piante ed animali Controllo della identità cellulare delle cellule staminali

83 I geni per i microrna sono molto abbondanti più di 100 in Arabidopsis tra 700 e 1000 nell uomo

84 Meccanismi del funzionamento di mirna in piante MicroRNA portano al taglio e degradazione di mrna La gran parte dei bersagli dei mirna nelle piante codifica per proteine regolatrici suggerendo che i mirna hanno una funzione gerarchicamente molto elevata mirna coinvolti nello sviluppo e nell identità delle cellule staminali

85 FUNZIONI FISIOLOGICHE DEI mirna Mantenimento dell identità cellulare (es. pluripotenza) L identità cellulare viene mantenuta silenziando mrnas che non appartengono allo specifico repertorio della cellula Network di mirna che controllano specifici pathway (mir- 21 regola mirna che controllano apoptosi: disregolazione di mir-21 cancro. mirna che controllano la via di segnale dell insulina, diverse tipologie cellulari hanno maggiore o minore necessità di glucosio quindi il funzionamento di questo network di mirna è regolato a seconda della tipologia cellulare)

86 mirna e cancro Tumori: pattern specifico di espressione dei mirna che permettono di discriminare i diversi tipi di cancro e di identificare il tessuto di origine delle metastasi

87 Network trascrittoma-microrna nel cancro

88 mirna e cancro mirna oncogeni: mirna overespressi nei tumori (es. mir-155 è upregolato in tumori maligni del sistema ematopoietico, della mammella, del polmone e del pancreas, mir-380-5p reprime p53 nel neuroblastoma, antagonizzandolo con un oligonucleotide antagonista migliora la prognosi) blocco dei mirna con oligonucleotidi antisenso mirna oncosoppressori: mirna ridotti o mancanti nei tumori. La loro overespressione limita la proliferazione o induce apoptosi (es. mir-15a- 16-1, downregolato in cellule B di pazienti con leucemia linfocitica cronica, adenomi della prostata e dell ipofisi) mirna mimics o vettori virali

89 Strategie per terapie anti-cancro basate su mirna: 1. Bloccare mirna oncogeni usando oligonucleotidi antisenso 2. Costrutti Locked nucleic acid (LNA) 3. mirna sponges 4. mir-mask 5. Small molecule inhibitors 6. Ripristinare l espressione di mirna oncosoppressori 7. Riprogrammare le cellule cancerogene

90 Benefits of the LNA technology Some of the benefits of using LNA include: Ideal for the detection of short RNA and DNA targets Increases the thermal stability of duplexes Capable of single nucleotide discrimination Resistant to exo- and endonucleases resulting in high stability in vivo and in vitro applications Increased target specificity Facilitates Tm normalization Strand invasion properties enables detection of hard to access samples Compatible with standard enzymatic processes

91 Limiti e vantaggi della terapia con mirna

92 FUNZIONI DELL'RNA NELLA CELLULA MODERNA traduzione maturazione rrna splicing maturazione trna sintesi DNA traslocaz. proteine rrna, mrna, trna snorna, snrna, introni gruppi I e II RNasi P primers, telomerasi srprna

93 RNA Interference: il processo attraverso il quale un RNA a doppio filamento interferisce con l espressione genica: sia inducendo la degradazione di RNA complementare che bloccandone la traduzione

94 Silenziamento Post-trascrizionale (1990) Jorgensen 1990: Introduzione di transgeni responsabili della pigmentazione della petunia per ottenere petunie più scure pigmentazione ridotta del 40% nelle petunie transgeniche ridotta espressione sia del gene endogeno che del transgene (cosoppressione) A variegated petunia. Upon injection of the gene responsible for purple colouring in petunias, the flowers became variegated or white rather than deeper purple as was expected.

95 1993: Viene identificato il primo mirna nel C. elegans 1998: Fire e Mello descrivono la presenza di RNA interference nel C. elegans 1999: il silenziamento genico nelle piante è accompagnato dall accumulo di piccoli frammenti di RNA (20-25 Nt) complementari al gene silenziato. dsrnas vengono ridotti a piccoli frammenti di Nt 2001: Tuschl et al. dimostrano nella Drosophila che una piccola sequenza di RNA può interferire in modo specifico con la trascrizione

96 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA" Andrew Z. Fire Craig C. Mello Stanford University University of Massachusetts b b. 1960

97 Small RNAs mirna sirna Prodotti in modo endogeno Funzione: regolazione dell espressione genica sopprimendo la traduzione o la trascrizione di geni target Exo-siRNA:Introdotti in modo esogeno (virus a dsrna, transposoni, transgeni) Endo-siRNA: derivati da loci genomici endogeni Funzione principale: rispondere alle minacce esterne sopprimendo la trascrizione genica dell invasore

98 Interferenza basata su RNA (RNA interference) Attori: Micro RNA (mirna) precursori a forcina Small interfering RNA (Si) (2 nt 3 protrundenti) Ribonucleasi DICER RISC (RNA driven interference silencing complex) che comprende: Argonaute, la proteina che srotola il doppio filamento e la ribonucleasi che taglia la sequenza senso a nt dal terminale 5.

99 Il complesso RISC attivato riconosce sequenze complementari di RNA, le lega e degrada: questo puo avvenire diverse volte in quanto l RNA antisenso, protetto dal complesso proteico è stabile e in cellule che si dividono lentamente puo agire per 3-7 giorni.

100 Risc unwinds dsrna, the ribonuclease in the Ribonuclease complex hydrolizes new targets

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102 sirna sintetico a doppio filamento RNA lungo a doppio filamento mirna endogeno shrna plasmidico NT Amplificazione RNA-dip RNA polimerasi funzione mirna Formazione del complesso RISC (RNA induced silencing complex) Complesso RISC attivato funzione sirna Blocco traduzione Formazione doppia elica con RNA complementare e attacco di endonucleasi

103 si RNA caratteristiche RNA a doppia elica di nt Presenza di terminale 3 più lungo di 2nt Presenza di gruppi OH in 3 Presenza 5 fosfato Alta stabilità nella porzione 5 senso(ricco in GC) Bassa stabilità nella porzione 5 antisenso(ricco UA) Bassa stabilità nella zona centrale dove deve avvenire l attacco della endonucleasi 2 desossitimidina per proteggere sirna da attività esonucleasiche Non deve essere complementare a zone introniche Complementare a una porzione di RNA a non più di 75 basi da codone di inizio trad.

104 si RNA caratteristiche

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106 CELLULE HeLa In rosso: sirna marcato In blu: nuclei In verde la proteina GAPDH si RNA non specifico si RNA contro GAPDH Trattamento: 48h

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108 sirna come agenti terapeutici LA SOMMINISTRAZIONE

109 sirna come agenti terapeutici LA SOMMINISTRAZIONE 1. Applicazione topica: instillazione di gocce, aerosol, iniezione intratumorale 2. Somministrazione sistemica: a. iv (molecole di circa 5nm riescono a passare le membrane, fino a 200 nm passano solo capillari fenestrati : uso di nanocarrier) b. RNA di sintesi modificati per migliorarne la farmacocinetica c. Utilizzo di vettori virali e non per esprimere l RNA della cellula bersaglio

110 sirna come agenti terapeutici LA SOMMINISTRAZIONE Modificazione delle molecole di sirna per una distribuzione più efficiente modificazioni per evitare le difese immunitarie (modificazione con 2 -o-metile nel filamento antisenso)

111 Metodi di somministrazione: FISICI Iniezione idrodinamica: efficace in epatociti ma invasiva Elettroporazione: campo elettrico che facilita la transfezione di acidi nucleici, utilizzata in vivo nel muscolo, retina, giunture artritiche e tumori DI CONIUGAZIONE

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113 sirna IN STUDI CLINICI

114 Potenziali effetti collaterali della terapia con sirna: 1. Attivazione del sistema immunitario 2. Effetti off-target 3. Saturazione di vie di silenziamento endogene (mirna)

115 Similarità e differenze con oligonucleotidi antisenso Similarità: Differenze: - lunghezza - metodologia di delivery comune - induzione di silenziamento genico a livello post-trascrizionale - digestione di RNAm bersaglio da parte di endonucleasi - possibilità di stabilizzazione con basi modificate - similarità nella biodistribuzione - doppio filamento verso singolo filamento - maggiore stabilità della molecola naturale - maggiore efficacia in cellule in coltura - meccanismo di azione mediato da RISC