Le proteine. Purificazione delle proteine: La purificazione di una proteina costituisce il primo passaggio nello studio delle sue proprietà.
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- Placido Boni
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1 Le proteine Purificazione delle proteine: La purificazione di una proteina costituisce il primo passaggio nello studio delle sue proprietà. Una proteina per poter essere purificata deve, dapprima, essere estratta dalla sua matrice biologica e quindi allontanata selettivamente dalle altre proteine. La strategia adottata dipende da una serie di fattori: 1) qualità: il tipo di studio che si vuole eseguire detta i limiti di purezza che è necessario raggiungere (per studi strutturali serve una purezza >>studi di cinetica) 2) quantità: La quantità di proteina che occorre recuperare influenza la scelta del metodo di purificazione 3) costi: il costo dei materiali (resine di affinità o scambiatrici ioniche) possono diventare fattori limitanti importanti soprattutto per purificazioni su grande scala Studio della concentrazione e funzione delle proteine 1. Estrazione delle proteine. Consiste nel fare uscire la proteina dalla cellula e ottenerla in soluzione. Le cellule devono essere rotte e il contenuto proteico rilasciato in una soluzione chiamata crude extract. Le cellule vengono sottoposte a condizioni stressanti (alte pressioni, cicli di cong/scong, utilizzo di detergenti, sonicazione). 2. Stabilizzazione della proteina. Una volta rimossa dalla cellula, la proteina si ritrova in condizioni non ottimali per la sua stabilità e funzionalità, quindi bisogna intervenire per ridurre le condizioni e/o gli agenti che possono danneggiarla irreversibilmente. 1
2 3. Separazione della proteina. Gli estratti cellulari sono poi sottoposti ad una varietà di metodiche per separare la proteina di interesse dal resto della miscela. Le cellule vengono rotte e il contenuto proteico rilasciato in un lisato. Le metodiche variano in base alla capacita di adesione delle cellule (aderenti o in sospensione) cellule aderenti: lavare le cellule sulla petri o fiasca con ice-cold PBS, eliminare PBS. Aggiungere ice-cold lysis buffer alle cellule. Le cellule vengono staccate dalla petri o fiasca usando cellscraper. cellule in sospensione: lavare le cellule con PBS centrifugando per pellettare le cellule. Risospendere il pellet cellulare in ice-cold lysis buffer. Nei processi di estrazione e purificazione delle proteine, a differenza di quanto visto per il DNA, non occorre prestare attenzione alla sterilità ma, invece, bisogna cercare di evitare la denaturazione dei campioni (elevate temperature, detergenti, valori estremi di ph possono denaturare facilmente le proteine). La procedura adottata per ottenere un estratto grezzo contenente la proteina da purificare dipende dalla localizzazione cellulare della proteina. Proteine extracellulari secrete nel brodo di coltura o nel siero, possono essere rimosse dal materiale insolubile per semplice centrifugazione. Gli enzimi intracellulari possono essere recuperati dopo rottura delle cellule. I metodi utilizzati per la rottura delle cellule dipendono in gran parte dalla fragilità delle cellule. 2
3 Cellule appartenenti ad un tessuto animale parenchimatoso possono essere lisate per shock osmotico seguito da congelamentoscongelamento. L impiego di mortaio e pestello è utile nel caso si abbia a che fare con piccole quantità di materiale, in presenza di materiale abrasivo. I tessuti animali vengono rotti con l uso di omogeneizzatori. Questi consistono di un pestello di vetro posto all interno di un tubo; il tessuto è forzato a passare tra le pareti del tubo che viene tenuto fermo e il pistone che si muove e ruota. Durante la rottura è opportuno controllare la temperatura (le forze frizionali che si generano producono calore) Per rompere le pareti cellulari possono anche essere impiegati gli ultrasuoni. Le pareti sono rotte dalle ondate pressorie che si generano. Anche in questo caso bisogna fare attenzione allo sviluppo di calore. 3
4 Le proteine di membrana presentano problemi particolari; le parti che attraversano la membrana devono essere mantenute in un ambiente idrofobico (per impedirne l aggregazione e mantenere l attività). La solubilizzazione di queste proteine spesso comporta l uso di detergenti non ionici per rivestire le parti della proteina che attraversano la membrana. Le cellule vengono rotte e il contenuto proteico rilasciato in un lisato Le metodiche variano in base alla localizzazione della proteina che si vuole separare (citosolica e/o nucleare) Localizzazione della proteina: Variando la composizione dei tamponi utilizzati per lisare le cellule si possono effettuare, oltre ai lisati totali, anche Lisati citosolici: contengono solamente le proteine presenti nel citosol, permettono quindi di eliminare quelle nucleari. Sfruttano la presenza di detergenti. Lisati nucleari: contengono solamente le proteine presenti nel nucleo, permettono quindi di eliminare quelle citosoliche. Sfruttano concentrazioni saline in grado di aprire i pori nucleari Estratti totali 2. Estratti citosolici 3. Estratti nucleari 4
5 Inibizione fosfatasi La fosforilazione è una modificazione post-traduzionale Altera l attività, le interazioni, la degradazione di una proteina. Circa 1/3 delle proteine presenti in una cellula di mammifero sono regolate tramite fosforilazione-defosforilazione. Vantaggi: rapidità processo, reversibilità, non richiede sintesi di nuove proteine o degradazione. Trasduzione segnale, ciclo cellulare, processi metabolici, apoptosi Quando si prepara un lisato proteico è opportuno aggiungere inibitori fosfatasi. Chiarificazione dell estratto Una volta che le cellule sono state rotte, l estratto grezzo che si è ottenuto deve essere ripulito prima di iniziare il frazionamento. Molte procedure di rottura cellulare rilasciano micelle di membrane, acidi nucleici, materiale aggregato, che potrebbero disturbare nei successivi passaggi di purificazione. La chiarificazione, in genere, si ottiene per centrifugazione ad alta velocità dell estratto grezzo. Se è presente molto materiale particolato, può essere rimosso tramite filtrazione su garza o su filtri di carta. Tecniche di frazionamento: Ci sono diverse tecniche di frazionamento che consentono di arricchire una miscela complessa di un determinato enzima. Il frazionamento è efficace se, ad ogni passaggio, aumenta la percentuale di proteina desiderata rispetto al contenuto totale di proteine presenti nel campione. 5
6 Frazionamento per denaturazione: si basa sulla diversa sensibilità al calore delle proteine. Si stabilisce su un piccolo campione la temperatura a cui la proteina cercata denatura. Si allontanano le altre proteine presenti nella miscela scaldando il campione fino ad una temperatura 5-10 C inferiore a quella critica per minuti. Le proteine così centrifugazione. denaturate sono rimosse per Frazionamento con sali: il genere si usa solfato di ammonio, dopo ogni aggiunta di sale la proteina viene precipitata e risospesa in tampone fresco. Tutti i passaggi sono condotti a 4 C. Salting out: processo che diminuisce la solubilità delle proteine grazie all aggiunta di determinate concentrazioni di sale. Principio: 1. gli ioni di sale aggiunto competono con gli ioni presenti nella soluzione per le molecole di solvente, facilitando l aggregazione proteica; 2. Proteine diverse precipitano a diverse concentrazioni di sale. Frazionamento con solventi organici: si basa sulla diversa solubilità delle diverse proteine in soluzioni acquose di solventi organici. Tale processo è condotto a 20 C per evitare la denaturazione. 6
7 Tecniche cromatografiche: Tali tecniche consentono di raggiungere un più alto grado di purezza. In generale tutti i sistemi cromatografici consistono di una fase stazionaria immobilizzata, che può essere solida, gel, liquida o una miscela solido/liquido, e di una fase mobile liquida o gassosa che flussa sopra o all interno della fase stazionaria. Nell adozione di un sistema cromatografico è necessario scegliere la fase stazionaria e la fase mobile in modo che i composti da separare siano caratterizzati da coefficienti di distribuzione diversi. 7
8 I tipi di cromatografia maggiormente utilizzati durante la purificazione di proteine sono i seguenti: di affinità: in questo caso si sfrutta una funzione biologica della proteina che si vuole isolare da una miscela di altre proteine che sono sprovviste della stessa capacità di riconoscere, e quindi legare, la fase stazionaria. di esclusione: separa le proteine in base al loro peso molecolare, di solito viene usata nell ultimo passaggio di purificazione scambio ionico: si fonda sull attrazione elettrostatica esistente tra due particelle cariche in modo opposto. 8
9 Tre tipi di matrici usate in cromatografia. Nella cromatografia a scambio ionico (A) la matrice insolubile porta cariche che ritardano il movimento delle molecole di carica opposta. Le matrici usate sono la dietilaminoetilcellulosa (DEAEcellulose), carica positivamente, la carbossimetilcellulosa (CM-cellulose) e la fosfocellulosa, carichi negativamente. Matrici analoghe basate su agarosio o altri polimeri sono usate frequentemente. La forza del legame tra le molecole in soluzione e la matrice a scambio ionico dipende dalla natura dello ione e dal ph della soluzione che viene fatta passare sulla colonna. Nella gel filtrazione (B) la matrice è inerte ma porosa. Le molecole vengono separate in base alle loro dimensioni e forma. Le molecole più piccole penetrano nella matrice e vengono costrette ad attraversare la colonna più lentamente. Resine di polisaccaridi (destrano, agarosio, o acrilammide) sono disponnibili e garantiscono porosità di differente portata, consentendo la separazione di molecole di diverso peso molecolare. La cromatografia di affinità (C) impiega una matrice insolubile legata in maniera covalente ad un ligando specifico (come un anticorpo o un substrato enzimatico) che lega una proteina specifica. Gli enzimi che legano I substrati immobilizzati su tali colonne possono venir eluiti con una soluzione concentrata del substrato libero, mentre le molecole che legano gli anticorpi immobilizzati possono venir eluite dissociando il complesso antigene-anticorpo con una soluzione ad alta concentrazione salina o con soluzioni che presentano alti o bassi valori di ph. 9
10 Immunoprecipitazione Sfrutta l alta affinità del legame tra l anticorpo e la proteina contro cui è stato prodotto. La specificita e l affinita degli anticorpi per i loro antigeni dipendono da una straordinaria complementarita strutturale tra le due molecole. L associazione tra anticorpo ed antigene coinvolge diverse interazioni:van der Waals, Idrofobiche, Legami idrogeno E costituita dalle seguenti fasi: preparazione lisati cellulari; pre-clear; formazione del complesso antigene di interesse/anticorpo; cattura del complesso antigene/anticorpo tramite prota o protg; recupero della proteina di interesse. Valutazione efficacia purificazione Per valutare se la purificazione sta procedendo con successo occorre ad ogni passaggio misurare l attività specifica della proteina e analizzare le proteine in SDS-PAGE. Proteine totali: la quantità di proteine totali presenti nel campione si determina tramite analisi della concentrazione (vedere diapositive successive) su un piccolo volume e moltiplicando per il volume totale di prodotto purificato. Attività enzimatica totale: se la proteina che si sta purificando è un enzima si può determinare la sua attività enzimatica (cioè la sua capacità di promuovere una reazione chimica) su un piccolo volume e moltiplicando per il volume totale di prodotto purificato. Attività specifica: attività totale/ proteine totali (se la purificazione è efficace deve aumentare ad ogni passaggio) 10
11 Analisi strutturale delle proteine Per comprendere la funzione di una proteina è necessario conoscere la sua struttura. Le tecniche a tal fine utilizzate sono: Cristallografia ai raggi X Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) Microscopia crioelettronica Cristallografia ai raggi X Nata negli anni 50, è ancora la tecnica più usata per determinare la struttura tridimenzionale delle proteine. Richiede che le proteine siano trasformate in cristalli statici. Fasci di raggi X con una lunghezza d onda abbastanza corta da risolvere gli atomi (0,1-0,2 nm) sono fatti passare attraverso un cristallo di proteina. Gli atomi del cristallo disperdono i raggi X e producono uno schema di diffrazione costituito da macchie distinte su una lastra fotografica. 11
12 Fino a macchie distinte possono essere ottenute da una piccola proteina. La struttura della proteina viene ricavata dallo schema di diffrazione. Cristallo spettro di diffrazione immagine del campione ricostruita al computer Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) L NMR permette lo studio della dinamica delle proteine in soluzione a risoluzione atomica. In questa tecnica, una soluzione concentrata della proteina è posta in un campo magnetico. Si misurano gli effetti di radiofrequenze diverse sulla risonanza di differenti atomi. Poiché è eseguita in soluzione, può rilevare i movimenti Intramolecolari. 12
13 Il comportamento di un atomo è influenzato dagli atomi circostanti dei residui adiacenti. I residui più vicini, pertanto, sono perturbati da quelli più distanti. Dalle dimensioni dell effetto si possono calcolare le distanze tra i residui. Queste distanze sono usate per generare un modello della struttura tridimensionale della proteina. L NMR si limita a proteine più piccole di 20kDa e a analizzare domini proteici. 1) Soluzioni proteiche sono analizzate mediante un campo magnetico 2) Trasformazione matematica dei dati grezzi in un grafico 3) Estrazione dei livelli di contiguità per l analisi di livelli strutturali successivi Microscopia crioelettronica La microscopia crioelettronica è utile per determinare la struttura di grandi complessi proteici che sono difficili da cristallizzare. Il campione proteico viene congelato di colpo a temperatura estremamente basse in elio liquido (da -180 a -260 C). Quando è congelata così rapidamente, la proteina è completamente idratata senza cristalli d acqua. 13
14 La struttura è esaminata in un microscopio crioelettronico e le immagini sono registrate su lastre usando una bassa dose di elettroni per impedire danni alla struttura indotti da radiazioni. Ciò permette di analizzare una proteina nella sua forma nativa, rispetto al materiale fissato nella microscopia elettronica convenzionale Determinazione della concentrazione delle proteine Per determinare la concentrazione delle proteine è necessario: a) Avere un campione a concentrazione nota (standard) b) Costruire una curva di standard c) Determinare la concentrazione dei campioni incogniti effettuando lo stesso test, in contemporanea, con la curva di standard. In genere si esaminano miscele contenenti proteine e altre sostanze (carboidrati, lipidi, acidi nucleici, detergenti, ) che possono influenzare le reazioni cromogene usate per determinare la concentrazione proteica. La misura è, quindi, una stima della concentrazione dei campioni. -Assorbanza a 280 e 260 nm Allo spettrofotometro si determina l assorbanza a 280nm (presenza del triptofano, tirosina, fenilalanina). Metodica non destruttiva (si può recuperare il campione) Interferenza acidi nucleici (correzione sottraendo assorbanza 260nm) Composizione AA varia A280 (è basato sull'assorbimento degli aminoacidi aromatici; i coefficienti di estinzione molare saranno quindi molto diversi da proteina a proteina 14
15 -Metodo del biureto In ambiente basico, Cu 2+ lega azoto peptidico riduzione a Cu 1+ Assorbimento 550nm Difetti: poco sensibile, interferenza Tris e Sali ammonici -Metodo BCA (acido bicincolinico) Reazione del biureto, in presenza di BCA. Due molecole di BCA chelano uno ione rameoso colorazione violetta (A560nm) Maggiore sensibilità Minore interferenza contaminanti (detergenti) -Metodo Bredford Prevede il legame di un colorante (Coomassie Brilliant Blue G-250) alle proteine A595nm Legame tramite interazioni elettrostatiche con gruppi aminici e carbossilici e tramite forze di van der Waals. 15
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