RAPPORTO DI PROVA N 1 /2007 ANALISI ISTOLOGICA E IN MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE DI BIOPSIA OSSEA

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1 41100 Modena Pagina 1 di 17 RAPPORTO DI PROVA N 1 /2007 Titolo: ANALISI ISTOLOGICA E IN MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE DI BIOPSIA OSSEA Committente : Materiale in esame : Ditta Allmed s.r.l. Via Nobel, Lissone (MI) biopsia ossea Responsabile Laboratorio Biomateriali: Dott. Antonietta M. Gatti Firma Data 07/02/07 Nota: I risultati sono da riferirsi solo al materiale esaminato e per il tipo di applicazione richiesta. Il Committente si impegna a riprodurre integralmente il presente rapporto di prova. La riproduzione parziale deve essere autorizzata dal Laboratorio Biomateriali.

2 41100 Modena Pagina 2 di 17 INDEX 1 INTRODUZIONE MATERIALI E METODI CAMPIONI DA ESAMINARE: PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PER L ANALISI ISTOLOGICA E SEM Analisi istologica Analisi in microscopia elettronica a scansione RISULTATI ANALISI ISTOLOGICA RISULTATI ANALISI IN MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE (SEM) DISCUSSIONE E CONCLUSIONI PARTECIPANTI ALLA PROVA E LORO FUNZIONI... 17

3 41100 Modena Pagina 3 di 17 1 INTRODUZIONE Nel presente rapporto, effettuato mediante analisi istologica e di microscopia elettronica a scansione, si è voluto verificare se una grossa lacuna ossea causata da una infezione con successiva perdita di 2 impianti dentali poteva essere rigenerata a scopo implantare, quindi con buona qualità ossea, inserendo dei biomateriali chiamati: Alos pasta e Alos blocco.. 2 MATERIALI E METODI 2.1 CAMPIONI DA ESAMINARE: Campione : carota bioptica ossea post estrazione dopo 5 mesi dall impianto con biomateriale Alos pasta e Alos blocco (Allmed srl, Lissone Milano) Dimensione del campione: 4 x1 mm Numero di campioni forniti: 1 Provenienza: Dott. Ghinzani Walterl, Lissone (MI) Data di ricevimento: 05/12/ PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PER L ANALISI ISTOLOGICA E SEM La biopsia ossea è giunta presso il nostro Laboratorio in una provetta da 15 ml immersa in liquido fissativo. Si è quindi proceduto alla processazione del campione mediante ulteriore fissazione in formalina tamponata, disidratazione per mezzo delle seguenti soluzioni di etanolo 60%, 70%, 80%, 95% e etanolo assoluto. Dopo la disidratazione, la biopsia veniva trattata per 10 ore con una miscela (1:1) di alcool assoluto/metacrilato di metile (MMA) e per una notte col solo MMA. La biopsia è stata poi trattata per 24 ore con la soluzione infiltrante (3 cambi consecutivi), è stata poi posta in un contenitore in polietilene a fondo piatto contenente la soluzione polimerizzante, chiuso ermeticamente e lasciato polimerizzare in un bagno di acqua, a 4 C per 36 ore. Il blocco di metacrilato è stato poi sezionato con un microtomo a lama circolare diamantata (Mod.Accutom-2, Struers) in modo da ottenere sezioni longitudinali della biopsia. Le sezioni ottenute sono state trattate separatamente per le seguenti analisi: osservazione istologica e con microscopio elettronico a scansione.

4 41100 Modena Pagina 4 di Analisi istologica La sezione è stata incollata con resina (Technovit 3100) su vetrino e dopo polimerizzazione della resina levigata con carte abrasive a grana con dimensione decrescente mediante lappatura con strumento (LS-1, Remet) e impiegando spray di pasta diamantate con la stessa scala di spessore (6 µm, 3 µm, 1 µm) per ottenere uno spessore finale di 60 µm. La sezione ottenuta veniva lavata con acqua bidistillata, colorata per 20 minuti in una soluzione di 1% di Blu di Toluidina (Fluka) in stufa a 60 C, lavata con acqua bidistillata, controcolorata mediante immersione in picro-fucsina di Van Gieson a temperatura ambiente per 4 minuti. Al termine della colorazione la sezione è stata lavata con etanolo assoluto e asciugata all aria e coperta con vetrino coprioggetto mediante montante acquoso (Eukitt) Analisi in microscopia elettronica a scansione Una sezione di 60 µm di spessore è stata lucidata mediante lappatura con strumento (LS-1, Remet, Italy) e con uso di spray di pasta diamantate con scala di spessore (6 µm, 3 µm, 1 µm), controllando la lucidatura mediante microscopio metallografico (Union, Japan). La sezione lucidata è stata poi fatta aderire ad un disco di carbone adesivo e posta su supporto di alluminio (stub) per l analisi SEM (ESEM-Qanta, Fei Company, Netherlands).

5 41100 Modena Pagina 5 di 17 3 RISULTATI ANALISI ISTOLOGICA L analisi istologica ha messo in evidenza che la biopsia conteneva osso neoformato, come è possibile vedere dalle immagini in fig. 1, 2 e 3, a diversi ingrandimenti ottenute da osservazioni con microscopio ottico a trasmissione. Tessuto osseo neoformato osteone biomateriale Fig.1: L immagine mostra la parte centrale della biopsia ossea. Sono riconoscibili gli osteoni, con gli osteociti nell area vicino al biomateriale, ed un area con il tessuto osseo neoformato (ingrandimento 20 X).

6 41100 Modena Pagina 6 di 17 Fig.2: Particolare dell immagine fig.1 che mostra l area comprendente osteone ed il biomateriale (Ingrandimento 40X). osteociti Fig.3 : Immagine che mette in evidenza la struttura concentrica dell osso neoformato, vicino all area del tessuto preesistente (Ingrandimento 60X).

7 41100 Modena Pagina 7 di 17 Fig.4 : L immagine mostra dettagli della biopsia; all interno delle lamelle ossee si notano gli osteociti. Ingrandimento (20X), Fig.5 : Nella figura si vedono gli osteociti all interno delle lamelle ossee, la presenza di numerosi osteociti indica una elevata proliferazione cellulare segno che le cellule sono a contatto con biomateriali che le stimolano positivamente e non le stanno danneggiando(ingrandimento 60X),

8 41100 Modena Pagina 8 di 17 4 RISULTATI ANALISI IN MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE (SEM) Le immagini successive mostrano dettagli delle biopsie ossee osservata in microscopia elettronica a scansione. 1 1 lacun lacune Fig. 6,7 : l immagine mostra baffi di tessuto osseo neoformato in strutture concentriche con orientamento diverso dalle lamelle ossee preesistenti. Si nota che la biopsia contiene essenzialmente osso neoformato tranne che in qualche lacuna (1,2,3,4). L osso è ben strutturato e presenta la classica forma lamellare con lacune istiocitarie.

9 41100 Modena Pagina 9 di 17 Le figure successive mostrano particolare di zone con piccoli residui di biomateriali biomateriale Fig. 8-9: Si osserva l area contenente il biomateriale vicino al tessuto osseo. (ingrandimento 40X)

10 41100 Modena Pagina 10 di 17 Fig. 10:Immagine della zona adiacente l osso (Ingrandimento 40X) Fig.11: L immagine mostra il particolare interfaccia osso-biomateriale.si può notare che l osso e il materiale hanno densità atomiche simili e che esiste una netta linea di demarcazione fra le due zone.(ingrandimento 60 X)

11 41100 Modena Pagina 11 di 17 La seguente immagine mostra la composizione chimica dell osso neoformato. Fig.12: Spettro EDS del tessuto osseo.

12 41100 Modena Pagina 12 di 17 Fig.13: La figura mostra un altro particolare del materiale racchiuso dentro una lacuna ossea.

13 41100 Modena Pagina 13 di 17 biomateriale Fig.14 : Immagine che mostra l interfaccia osso biomateriale, ad alto ingrandimento è visibile il materiale a stretto contatto con l osso. Il materiale non si presenta omogeneo, forse a causa della sua degradazione, all interno si osserva nuove strutture ossee.

14 41100 Modena Pagina 14 di 17 Tessuto neoformato Fig.15 : In questa immagine si nota il tessuto neoformato che si evidenzia con una zona più scura. L immagine mostra osso neoformato e una certa quantità di materiale che si sta degradando.

15 41100 Modena Pagina 15 di 17 Fig.16: Spettro EDS del tessuto osseo neoformato.

16 41100 Modena Pagina 16 di 17 Fig.17: L immagine mostra un area in cui il biomateriale si trova fuori dalla nicchia ossea e che si sta degradando

17 41100 Modena Pagina 17 di 17 5 Discussione e conclusioni L analisi istologica mostra chiaramente che la biopsia, colorata con picro-fucsina, presenta strutture osteoniche contenenti osteociti (fig. 2 e 3), si tratta di osso neoformato e ben strutturato. L analisi in microscopia elettronica a scansione conferma che la tasca ossea, che era stata riempita con Alos pasta/blocco, è stata completamente riempita da tessuto osseo neoformato dopo 5 mesi d impianto. E ancora visibile in alcune zone l interfaccia osso-biomateriale. All interno di alcune piccole zone è ancora visibile parte del materiale che comunque si sta degradando, lasciando spazio all osso neoformato. L analisi EDS dimostra che la composizione chimica del tessuto osseo neoformato ha un rapporto Ca/ P tipico dell apatite. In conclusione si può affermare che l inserimento di Alos pasta ed Alos Blocco in chirurgia implantare, stimola la rigenerazione ossea in breve tempo con conseguente formazione di nuovo tessuto mineralizzato che è in grado di colmare la lacuna. 6 Partecipanti alla prova e loro funzioni 1. Dott. Antonietta M. Gatti Qualifica professionale: Bioingegnere, Responsabile del Laboratorio e coordinatore delle attività di ricerca, stesura rapporto. 2. Dott. Roberta Salvatori Qualifica professionale: Tecnico di laboratorio biomedico, Funzione: preparatore dei campioni per l analisi 3. Dott. Andrea Gambarelli: Qualifica professionale: Biologo. Funzione: analisi SEM. Modena, 07/02/07 Il responsabile Dott.ssa Antonietta M Gatti

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