Tripletta di nucleotidi che codifica un dato amminoacido

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1 La sintesi proteica

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3 Amminoacido Sito di legame dell amminoacido Adattatore Tripletta di nucleotidi che codifica un dato amminoacido

4 Inserzione Delezione Inserzione e delezione Cornice di lettura ripristinata

5 Codice non sovrapposto Codice sovrapposto

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11 Il codice genetico Seconda lettera del codone Prima lettera del codone (in direzione 5 )

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13 mrna modificato Modificazione del trascritto di RNA corrispondente al gene per la subunità II della citocromo ossidasi da parte dei mitocondri di Trypanosoma brucei. L inserzione di quattro residui di uridina produce un diverso quadro di lettura.

14 RNA guida Probabilmente nei mitocondri di Trypanosoma brucei esiste un particolare tipo di RNA guida complementare all RNA modificato che agisce da stampo durante il processo.

15 Un processo di deamminazione provoca la trasformazione di un codone.

16 Il codice genetico è degenerato

17 Appaiamento di codoni e anticodoni. L allineamento dei due RNA è di tipo antiparallelo

18 Appaiamento del codone nel caso che l anticodone contenga l inositato come prima base Alcuni trna contengono in prima posizione il nucleotide inositato (I), che contiene l inconsueta base ipoxantina. L inositato può formare legami idrogeno con tre diversi nucleotidi U, C e A. Lo stesso trna può riconoscere vari codoni; il numero di trna per ciascun amminoacido non è pertanto necessariamente uguale al numero dei suoi codoni.

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26 Le molecole di trna La molecola di trna serve come un adattatore che si lega a ciascun codon e che trasporta con sé l amminoacido destinato a essere inserito nella catena proteica.

27 trna dell alanina (trna Ala ) di lievito Sito di attacco per l amminoacido = basi modificate Ψ = pseudouridina I = Inosina T = ribotimidina D = 5,6-diidrouridina m 1 I = 1-metilinosina m 1 G = 1-metilguanosina Tripletta dell anticodone m 2 G = N 2 -dimetilguanosina

28 Le molecole di trna hanno una struttura simile Tutte le molecole di trna hanno le seguenti caratteristiche: Sono costituite da una catena singola e contengono da 73 a 93 ribonucleotidi Contengono molte basi insolite, in genere da 7 a 15 per molecola.. Alcune sono derivati metilati o demetilati di A, U, C e G, formati da modificazioni enzimatiche di un trna precursore Circa la metà dei ribonucleotidi sono appaiati tra loro, formando tratti a doppia elica. Cinque gruppi di basi non sono appaiati: 1. la regione CCA all estremit estremità 3,, che fa parte dello stelo accettore; 2. l ansa TΨC, T, che prende il nome dalla sequenza ribotimina- pseudouracile- citosina; 3. il braccio extra o variabile, che contiene un numero variabile di residui; 4. l ansa DHU,, che contiene numerosi residui di diidrouracile 5. l ansa dell anticodon

29 Le molecole di trna hanno una struttura simile L estremità 5 di ogni trna è fosforilata; ; il residuo terminale 5 5 è di solito pg L amminoacido attivato è legato a un gruppo ossidrilico del residuo di adenosina che si trova all estremità 3 della sequenza terminale CCA dello stelo accettore L anticodon si trova in un ansa che si trova in corrispondenza della parte centrale della sequenza

30 Struttura generale secondaria a trifoglio di tutti i trna Ansa dell amminoacido Ansa D Ansa Contiene due tre residui D in posizioni differenti Ansa extra con dimensione variabile, e presente solo in alcuni trna Posizione oscillante Anticodone Ansa dell anticodone

31 Struttura a L del trna Nel 1974 è stata determinata la prima struttura tridimensionale di un trna (Phe-tRNA)) (Rich( e Klug) La molecola ha una forma a L

32 Struttura a L del trna La molecola ha una forma a L Vi sono due tratti apparentemente continui a doppia elica (simile al DNA in forma A). L elica contenente le estremità 5 e 3 3 forma insieme all elica che termina con l ansa TΨCT il braccio orizzontale della struttura a L La maggior parte delle basi delle regioni non elicoidali formano egualmente legami idrogeno con appaiamenti diversi da quelli del modello di Watson e Crick La regione CCA con il sito di legame dell amminoacido si trova a un estremit estremità della struttura a L L ansa dell anticodone si trova all estremit estremità opposta della L

33 Ansa Ansa dell amminoacido Ansa D (10-25 residui) Ansa dell anticodone Anticodone

34 La struttura dei trna è perfettamente adatta al suo ruolo: 1. l anticodon è disponibile per interagire con il codon appropriato sull mrna mrna; 2. l estremità legata all amminoacido amminoacido attivato è in posizione adatta per formare il legame peptidico

35 Le amminoacil-trna sintetasi leggono il codice genetico Il legame di un amminoacido e un trna è fondamentale: L attacco di un dato amminoacido a uno specifico trna determina il codice genetico La formazione di un legame peptidico tra amminoacidi liberi non è una reazione termodinamicamente favorita. E necessario che l amminoacido l sia attivato prima di essere legato in una catena polipeptidica. Nella sintesi proteica gli intermedi attivati sono esteri degli amminoacidi, nei quali il loro gruppo carbossilico è legato al gruppo -OH 2 2 o 3 3 dell unit unità di ribosio che si trova all estremit estremità 3 del trna (amminoacil-trna) Nella prima fase della sintesi proteica i 20 amminoacidi vengono legati mediante legame estere al loro trna ad opera di amminoacil-trna sintetasi. Generalmente esiste un amminoacil amminoacil-trna sintetasi per ciascun amminoacido. Per amminoacidi che hanno due o più trna corrispondenti, di solito la stessa amminoacil-trna sintetasi provvede alla amminoacilazione di tutti.

36 Gli amminoacidi sono inizialmente attivati mediante adenilazione La prima tappa nella formazione di un amminoacil-trna è la formazione di un amminoacil adenilato a partire da un amminoacido e ATP. L intermedio amminoacido-amp non si dissocia dall enzima La tappa successiva è il trasferimento dell amminoacido a una particolare molecola di trna: Amminoacil-AMP AMP + trna amminoacil-trna + AMP La reazione complessiva catalizzata da un amminoacil amminoacil-trna sintetasi è la seguente: Mg 2+ Amminoacido + trna + ATP amminoacil-trna + AMP + PPi 2P i

37 Le amminoacil-trna sintetasi hanno siti di attivazione degli amminoacidi altamente specifici Una sintetasi aggiunge a un trna un amminoacido sbagliato una volta su 10 4 o 10 5 reazioni catalitiche. Ogni sintetasi riconosce specificamente le proprietà dell amminoacido che funge da suo substrato La treonil-trna trna sintetasi ha uno ione zinco che si coordina alla treonina tramite il suo gruppo amminico e il suo gruppo ossidrilico

38 La correzione di bozze da parte delle amminoacil-trna sintetasi aumenta la fedeltà della sintesi proteica Studi strutturali e di mutagenesi hanno dimostrato che molte sintetasi hanno un sito di correzione di bozze situato ad una distanza di circa 20 Å dal sito di attivazione In genere il sito del legame acilico respinge gli amminoacidi più grandi di quelli corretti (non ha spazio sufficiente), il sito di idrolisi scinde le specie attivate più piccole di quelle corrette.

39 La correzione di bozze da parte delle amminoacil-trna sintetasi Il braccio flessibile CCA di un amminoacil trna può spostare l amminoacido tra il sito di attivazione e il sito di correzione di bozze

40 Alcune amminoacil-trna sintetasi possiedono attività proofreading Nel caso della Ile-tRNA sintetasi è stato dimostrato che l enzima presenta un secondo sito attivo (sito di proofreading) che catalizza la deacilazione degli amminoacil-amp sbagliati. Alcune amminoacil-trna possiedono strette affinità proofreading. sintetasi, che attivano amminoacidi che non strutturali con altri, sono prive di attività

41 In che modo le sintetasi riconoscono e scelgono i trna? Questo riconoscimento è responsabile effettivamente della traduzione,, cioè della correlazione tra amminoacidi e acidi nucleici Le sintetasi sono le molecole biologiche che conoscono il codice genetico

42 Le sintetasi riconoscono le anse dell anticodon e gli steli accettori delle molecole di trna Poiché ciascun trna ha un anticodon diverso,, molte sintetasi riconoscono i rispettivi trna soprattutto in base all anticodon anticodon,, anche se possono riconoscere altri aspetti della struttura del trna. Complesso della treonil-trna sintetasi La sintetasi è legata sia allo stelo accettore sia all ansa dell anticodon

43 Alcune sintetasi riconoscono oltre alle anse dell anticodon e gli steli accettori altre regioni delle molecole di trna Complesso della glutammil-trna sintetasi La sintetasi interagisce non solo con lo stelo accettore e l ansa dell anticodon, ma anche con la coppia di basi G10:C25

44 Per alcune sintetasi la formazione specifica di un legame amminoacilico è possibile anche se manca completamente l ansa l dell anticodon Microelica riconosciuta dall alanil-trna sintetasi L alanil-trna sintetasi riconosce una piccola ansa contenente solo 24 nucleotidi, corrispondente allo stelo accettore

45 Nucleotidi mancanti Gli elementi strutturali del trn Ala riconosciuti dalla Ala-tRNA sintetasi sono insolitamente semplici

46 Posizioni del trna riconosciute dall amminoacil amminoacil-trna sintetasi Ansa dell amminoacido Ansa D Ansa = posizioni uguali in tutti i trna Ansa extra = punti di riconoscimento di una amminoacil trna sintetasi = punti di riconoscimento di più amminoacil trna sintetasi Ansa dell anticodone Anticodone

47 Le amminoacil-trna sintetasi sono state divise in due classi in base alle differenze nella struttura primaria e terziaria e nel meccanismo di azione. Gli enzimi di classe I formano un legame acilico con il gruppo ossidrilico in posizione 2 dell adenosina terminale del trna Gli enzimi di classe II (eccetto quello per la Phe-tRNA trna) ) formano un legame acilico con il gruppo ossidrilico in posizione 3. Le due classi legano l ATP l in conformazioni diverse Quasi tutti gli enzimi di classe I sono monomerici,, mentre quasi tutti quelli di classe II sono dimerici o multimerici.

48 Le amminoacil-trna sintetasi attaccano il corretto amminoacido ai trna

49 Classe I Classe II

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51 Gln-tRNA sintetasi di E. coli (enzima monomerico di tipo I)

52 Asp-tRNA sintetasi di lievito (enzima dimerico di tipo II)

53 Struttura generale degli amminoacil-trna

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56 Ciascuno degli RNA ribosomiali a singola elica possiede una specifica conformazione tridimensionale conferita da appaiamenti delle basi.

57 Gli RNA ribosomiali hanno un ruolo centrale nella sintesi proteica Gli RNA ribosomiali sono ripiegati in strutture precise, con numerosi brevi tratti a doppia elica. Per molti anni si è ritenuto che la sintesi proteica fosse organizzata e diretta dalle proteine. L opinione attuale è invece opposta. I siti attivi del ribosoma sono composti quasi interamente da RNA 16S

58 Il ribosoma ad alta risoluzione = RNA 23S = RNA 5S = RNA 16S = proteine della subunità 50S = proteine della subunità 30S

59 Struttura del ribosoma batterico

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61 La sintesi proteica inizia all estremit estremità ammino-terminale e procede verso l estremità carbossi-terminale = residui di leucina radioattivi Catena α dell emoglobina

62 Il codone di inizio AUG specifica un residuo di metionina amminoterminale Nei batteri il residuo amminoacidico di avvio è la N- Formilmetionina, che penetra nel ribosoma associata ad uno specifico trna (N- Formilmetionina - trnaf Met ). Formilmetionina Negli eucarioti tutti i polipeptidi iniziano con un residuo di Metionina (invece che fmet), ma anche in questo caso viene usato un trna specializzato diverso da quello usato per l inserimento della metionina nelle posizioni interne.

63 Formilazione del metionil-trna trna Il trna di inizio è prima caricato con la metionina, poi viene trasferito un gruppo formile sul metionil-trna

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65 Sequenza Shine-Dalgarno La sequenza Shine-Dalgarno viene riconosciuta da una sequenza complementare ricca di pirimidine vicino all estremità 3 del rrna 16S della subunità 30S. Questa interazione mrna-rrna immobilizza l mrna in modo che l AUG sia posizionato sulla subunità 30S per l inizio della traduzione.

66 I ribosomi hanno 3 siti di legame per il trna, localizzati tra le subunità 30S e 50S Sito A (amminoacidico); Sito P (peptidico) e Sito E (sito di uscita)

67 Meccanismo della sintesi proteica

68 Formazione del legame peptidico Il gruppo amminico dell amminoacil amminoacil-trna produce un attacco nucleofilo sul gruppo carbonilico del legame estere del peptidil-trna trna,, formando un intermedio tetraedrico. Il centro della peptidil transferasi contiene basi che favoriscono la reazione aumentando la reattività del gruppo NH 2 sull aminoacil aminoacil-trna nel sito A e stabilizzando l intermedio l tetraedico che si produce L intermedio si dissocia, generando il legame peptidico e rilasciando il trna privo dell amminoacido

69 Via di fuga del polipeptide La subunità 50S è attraversata da un tunnel che inizia nel sito di formazione del legame peptidico. La catena polipeptidica nascente passa attraverso il tunnel

70 Un possibile ruolo della formilazione Se il gruppo amminoterminale è libero, il dipeptidil-trna trna può formare un legame interno, ciclizzandosi e separandosi dal trna. La formilazione dell estremit estremità amminoterminale blocca questa reazione

71 L inserimento di uno specifico amminoacido è determinato esclusivamente dalle interazioni codon-anticodon Legando a trna amminoacidi non naturali con metodi chimici è possibile sintetizzare peptidi nei quali sono presenti tali residui E inserito in corrispondenza di un codone per la cisteina

72 Alcune molecole di trna riconoscono più di un codon,, a causa dell oscillazione nell appaiamento delle basi Una certa libertà sterica ( oscillazione )) nell appaiamento della terza base del codon permette i seguenti appaiamenti: Prima base dell anticodon C A U G I Terza base del codon G U A o G U o C U, C o A

73 Possibili appaiamenti dell inosina

74 Interazioni codon anticodon Le prime due basi di un codon si appaiano in modo standard e il riconoscimento è preciso. I codoni che differiscono in una o l altra delle prime due basi devono essere riconosciuti da diversi trna. La prima base di un anticodon determina se una molecola di trna è in grado di leggere uno o più codon. A o C viene letto 1 codon U o G 2 codon I3 codon Nella subunità 30S vi sono 2 adenine (A1492 e A1493) che formano legami idrogeno sul lato del solco minore della doppia elica codon-anticodon: queste interazioni servono a controllare se sono presenti appaiamenti Watson e Crick nelle prime due posizioni. Nella terza posizione non esiste un sistema di rivelazione simile.

75 L inizio della sintesi proteica nei batteri richiede: a) La subunità ribosomale 30S b) l mrna c) l fmet-trna fmet d) I fattori d inizio IF-1, IF-2 e IF-3 e) GTP f) La subunità ribosomale 50S g) Mg 2+ Il legame di IF-1 e IF-3 alla subunità 30S impedisce che quest ultima si leghi prematuramente alla subunità 50S. Il fattore IF-2 lega il formil-metionil-trna f e contribuisce al suo corretto posizionamento I ribosomi batterici hanno tre siti che legano gli amminoacil-trna: il sito amminoacilico o sito A, il sito peptidilico o sito P e l uscita o sito E.

76 no Shine-Dalgarno Complesso d inizio negli eucarioti

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78 L allungamento L allungamento richiede: a) Il complesso d inizio b) Gli amminoacil-trna d) I fattori di allungamento (EF-Tu, EF-Ts e EF-G nei batteri) e) GTP Fase I Unione del secondo amminoacil-trna

79 Il fattore di allungamento Tu La molecola di trna da inserire nel sito A viene trasportata da una proteina detta fattore di allungamento Tu (EF-Tu) EF-Tu, un membro della famiglia delle proteine G, lega l amminoacil-trna solo quado ha legato a sé il GTP -EF-Tu protegge dall idrolisi il labile legame estere dell amminoacil-trna -Il GTP legato all EF-Tu è idrolizzato solo quando si forma una corretta associazione tra il complesso EF- Tu e il ribosoma (accuratezza della sintesi proteica) - Il fattore di allungamento Ts si unisce al complesso EF-Tu.GDP e favorisce la dissociazione del GDP EF-Tu non interagisce con l fmet-trna f ma riconosce il Met-tRNA. Il trna di inizio non è trasportato sul sito A e i codon AUG interni non sono letti dal trna di inizio. IF2 riconosce solo il l fmet-trna f.

80 Fase II Formazione del legame peptidico Il gruppo α-amminico dell amminoiacido nel sito A agisce da nucleofilo, spostando il trna nel sito P per formare un legame peptidico L attività enzimatica che catalizza la formazione del legame peptidico viene chiamata peptidil transferasi ed è probabilmente il ribozima dell rrna 23S.

81 Fase III - Traslocazione Il ribosoma si muove di una lunghezza pari a un codone verso l estremità 3 dell mrna. Il dipeptidil-trna si sposta dal sito A al sito P e il trna deacilato viene spostato dall iniziale sito P al sito E. Il trna verrà poi rilasciato dal sito E nel citosol. Lo spostamento del ribosoma richiede EF-G ed energia fornita dall idrolisi del GTP.

82 Mimetismo molecolare EF-Tu complessato con il trna EF-G complessato con il GTP La struttura di Ef-G mima la struttura del complesso EF-Tu Tu/tRNA suggerendo che EF-G G possa legarsi al sito A e spostare il peptidil-trna trna.

83 Meccanismo di traslocazione 1. Ef-G si lega al sito di legame di EF-Tu sulla subunità 50S 2. L idrolisi del GTP induce un cambiamento conformazionale in EF-G G che inserisce lo stelo nel sito A della subunità 30S 3. I trna e l mrnal si spostano di una distanza corrispondente a un codon

84 Guanosina 5 -O-(3-tiotrifosfato) (GTPγS)

85 Fase IV - La terminazione L allungamento prosegue finchè il ribosoma aggiunge l ultimo amminoacido. La terminazione è segnalata da uno dei tre codoni di terminazione dell mrna (UAA, UAG, UGA), che segue il codone dell ultimo amminoacido. Quando un codone di terminazione occupa il sito A sul ribosoma, tre fattori di terminazione, RF 1, RF 2 e RF 3 provvedono ad effettuare a) Idrolisi del legame terminale del peptidiltrna; b) Rilascio del polipeptide libero e dell ultimo trna; c) Dissociazione del ribosoma 70S nelle sue subunità 30S e 50S.

86 Fase IV - La terminazione (b) RF 1 riconosce i codoni UAG e UAA mentre RF 2 riconosce i codoni UGA e UAA RF 1 o RF 2 (a seconda di quale codone è presente) si lega al codone di terminazione e induce la peptidil transferasi a trasferire la catena polipeptidica a una molecola d acqua invece che a un altro amminoacido La funzione di RF 3 è quella di regolare le interazioni di RF 1 e RF 2 con il ribosoma Negli eucarioti, un unico fattore di rilascio, erf riconosce tutti e tre i codoni di terminazione. Per il rilascio del trna e dell mrna dal ribosoma 70S è necessario un ulteriore fattore proteico detto fattore di rilascio del ribosoma (RRF) e l EF-G che richiedono GTP

87 Struttura di un fattore di rilascio eucariotico Un fattore di rilascio eucariotico ha una struttura simile a quella del trna. In corrispondenza dell etremit etremità della struttura che ricorda lo stelo accettore è presente la sequenza Gly-Gly Gly-GlnGln che lega una molecola di acqua. La molecola di acqua è così trasportata in corrispondenza del centro della peptidil transferasi

88 Un polisoma La traduzione simultanea di un singolo mrna da parte di numerosi ribosomi permette di utilizzare l mrna in modo molto efficiente.

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90 Per vedere questa immagine occorre QuickTime e un decompressore Animation.

91 Accoppiamento della trascrizione e della traduzione nei batteri

92 Le catene polipeptidiche neosintetizzate vanno poi incontro a ripiegamenti e modificazioni Modificazioni post-traduzionali: 1) Modificazioni ammino-terminali e carbossi-terminali 2) Perdita della sequenza segnale

93 3) Modificazione di singoli amminoacidi Fosfoserina Fosfotreonina Fosfotirosina

94 γ-carbossiglutammato

95 Metillisina Dimetillisina Trimetillisina Metilglutammato

96 4) Aggiunta di gruppi isoprenilici Proteina Ras Farnesil pirofosfato Proteina Ras farnesilata

97 Modificazioni post-traduzionali: 5) Aggiunta di catene laterali di carboidrati a residui di Asn (oligosaccaridi legati in N) o a residui di Ser e Thr (oligosaccaridi legati in O). 6) Aggiunta di gruppi prostetici 7) Modificazioni proteolitiche 8)Formazione di legami disolfuro.

98 La sintesi proteica viene inibita da molti antibiotici e tossine L antibiotico puromicina, prodotta dalla muffa Streptomyces alboniger, assomiglia a un estremità 3 di un amminoacil-trna carico e si può legare al sito A del ribosoma, dove può partecipare alla formazione del legame peptidico. La formazione del legame peptidico porta alla formazione di peptidil-puromicina, che si dissocia dal ribosoma, determinando la terminazione prematura della catena.

99 Peptidil puromicina

100 Tetraciclina Le tetracicline bloccano il sito A del ribosoma

101 Cicloesimide La cicloesimide blocca la peptidil transferasi eucariotica, ma non quella batterica.

102 Cloramfenicolo Il cloramfenicolo blocca la peptidil transferasi batterica, ma non quella eucariotica.

103 Streptomicina La streptomicina causa l errata lettura del codice genetico nei batteri a concentrazioni basse e inibisce l inizio della sintesi proteica a concentrazioni più alte.