Dal DNA alle proteine

Transcript

1 La trascrizione

2

3 Dal DNA alle proteine Il flusso dell informazione genetica da DNA a RNA (durante la fase che chiamiamo trascrizione) e successivamente da RNA a proteine (attraverso la fase che chiamiamo traduzione) avviene in tutte le cellule viventi. Questo concetto così fondamentale e ampio è stato definito Dogma Centrale della biologia molecolare.

4 Differenti efficienze di espressione genica I geni codificati dal DNA non vengono trascritti e tradotti in modo omogeneo. Infatti a seconda di quelle che sono le necessità della cellula (spesso legate alla funzione da essa svolta nel tessuto e nell organismo di appartenenza), alcuni geni sono espressi molto più efficientemente ch altri. Questa regolazione fine dell espressione genica porta ad avere nell esempio più proteina A che B.

5 Struttura dell RNA RNA, come il DNA, è un polimero lineare composto da quattro nucelotidi legati insieme attraverso legami covalenti detti fosfodiesterici. Ci sono tuttavia delle differenze di natura chimica tra le due molecole. 1) i nucleotidi sono ribo-nucleotidi, ossia contengono lo zucchero ribosio. 2) al posto della Timina, troviamo l Uracile che differisce dalla Timina per l assenza di un gruppo-ch3.

6 La trascrizione assicura che il filamento letto venga copiato in maniera fedele, solo quando esiste un appaiamento ottimale tra la base di RNA che deve essere inserita nel polimero e la base presente sul filamento di DNA che funziona da stampo, il ribonucleotide viene legato covalentemente alla molecola di RNA nascente. Nella figura, la sequenza di colori del RNA è complementare a quella del filamento stampo di DNA. Teoricamente non si ammettono errori.

7 I principali tipi di RNA prodotti dalle cellule Nella cellula esistono diversi tipi di RNA, tra questi spiccano sicuramente tre tipi: l'rna messaggero (mrna) che porta il codice genetico sul sito della sintesi proteica. L'RNA transfer (trna) è costituito da piccole molecole a forma di trifoglio, ciascuna delle quali porta uno specifico aminoacido. A ogni codone dell'mrna (un codone è la sequenza di tre basi azotate, specifica per ogni aminoacido) corrisponde un anticodone del trna. Infine, l'rna ribosomiale (rrna) è il principale costituente dei ribosomi, i microscopici organuli cellulari su cui avviene la sintesi proteica.

8 . RNA polimerasi Tuttavia, la molecola destinata a gestire questo processo: RNA polimerasi, compie almeno un errore ogni 10 4 nucleotidi copiati in RNA (la DNA polimerasi è molto più accurata, facendo un errore ogni 10 7 nucleotidi). Nonostante questa ridotta accuratezza, se un ribonucleotide non corretto viene aggiunto all RNA in crescita, la polimerasi può tornare indietro ed il sito attivo dell enzima può scindere il nucleotide con una reazione che è l opposto di quella di polimerizzazione. L enzima si ferma maggiormente su un nucleotide sbagliato di quanto faccia su un nucleotide aggiunto correttamente. Le RNA pol possono dare inizio ad una catena senza bisogno di alcun primer. Da un lato si ha una minore accuratezza sull inizio del processo, dall altro il processo può essere più veloce.

9 Trascrizione The biosynthesis of RNA, called transcription, proceeds in much the same fashion as the replication of DNA and also follows the base pairing principle. Again, a section of DNA double helix is uncoiled and only one of the DNA strands serves as a template for RNA polymerase enzyme to guide the synthesis of RNA. After the synthesis is complete, the RNA separates from the DNA and the DNA recoils into its helix. The transcription of a single RNA strand is illustrated in the graphic on the left. One major difference is that the heterocyclic amine, adenine, on DNA codes for the incorporation of uracil in RNA rather than thymine as in DNA. Remember that thymine is not found in RNA and do not confuse the replacement of uracil in RNA for thymine in DNA in the transcription process. For example, thymine in DNA still codes for adenine on RNA not uracil, while the adenine on DNA codes for uracil in RNA. Note that the new RNA (red) is identical to non coding DNA with the exception of uracil where thymine was located in DNA

10 RNA polimerasi L enzima si muove gradualmente lungo il filamento svolgendo l elica di DNA ed usando uno dei due filamenti come stampo per la generazione di un filamento di RNA. Quindi il filamento di RNA neoformato è una copia del filamento di DNA.

11 La Trascrizione nei batteri. L RNA polimerasi è un complesso multiproteico contenente un fattore detto sigma che è staccabile L RNA pol si possono attaccare solo debolmente al DNA. Tuttavia quando l RNA pol incontra una particolare sequenza di DNA definita sequenza promotore vi si attacca con forza ed inizia la trascrizione. Questa particolare sequenza viene riconosciuta tramite il fattore sigma. Dopo questo fenomeno la pol apre il DNA per un breve tratto ed uno dei due filamenti inizia a svolgere il ruolo di stampo. Dopo la sintesi dei primi ribonucleotidi il fattore sigma si stacca e la trascrizione avanza rapidamente fino a che la pol incontra un segnale sul DNA detto terminatore che la fa prima fermare e poi staccare (preceduto da una sequenza simmetrica che formerà una forcina ). Nei batteri il segnale terminatore è una serie di A e T preceduta da una sequenza simmetrica.

12 Non tutte le sequenze hanno le caratteristiche per essere riconosciute dal fattore sigma, la serie delle caratteristiche che una sequenza deve avere per essere riconosciuta è definita consenso. La sequenza precisa di questa consenso determina la forza del promotore ossia la capacità di attrarre le polimerasi. I promotori dei geni più abbondanti sono più forti dei promotori dei geni più rari. Alla stessa maniera dei promotori, anche i terminatori contengono una vasta gamma di sequenze. Nelle cellule eucariotiche la situazione è simile. Le sequenze dei promotori solitamente sono asimmetriche. Poiché il DNA ha due filamenti due molecole di RNA potrebbero essere trascritte da qualsiasi posizione usando ciascun filamento di DNA come stampo. L unica imposizione è che la trascrizione avvenga in direzione 5 >3 e che quindi sia sempre lo stampo 3 >5 ad essere impiegato. Chiaramente le direzioni saranno opposte. La scelta del filamento stampo per ciascun gene è determinata dalla posizione e dall orientamento del promotore

13 Una differenza sostanziale tra i batteri e le cellule eucariotiche è rappresentata dal fatto che i procarioti hanno solo una RNA polimerasi mentre gli eucarioti ne possiedono tre: l RNA polimerasi I, II e III. Nonostante esse abbiano certe sub-unità in comune, esse trascrivono geni diversi. Le RNA polimerasi I e III trascrivono geni che codificano RNA transfer, RNA ribosomali e piccoli RNA. L RNA polimerasi II trascrive la maggioranza dei geni che codificano proteine. La pol II eucariotica e quella batterica sono strettamente correlate ma ci sono almeno due differenze sostanziali tra questi enzimi: 1) Mentre la pol batterica più il fattore sigma possono iniziare la trascrizione su uno stampo di DNA anche in vitro e senza altre proteine, la pol II eucariotica richiede l aiuto di diverse proteine accessorie per iniziare a trascrivere. Queste proteine vengono dette Fattori trascrizionali generali. 2) negli eucarioti l inizio della trascrizione deve tenere in conto lo stato di compattamento della cromatina.

14 Per iniziare la trascrizione di un gene la RNA pol II richiede molti fattori generali della trascrizione (proteine) che servono per piazzare la pol sul promotore, iniziare la trascrizione e rilasciare la pol dal promotore quando inizia la trascrizione TFIID serve per iniziare l attacco del complesso di trascrizione ad una sequenza di DNA ricca di T ed A definita TATA box piazzata 25 basi dall inizio della trascrizione. Altri fattori vengono poi assemblati per consentire l inizio della trascrizione formando un complesso d inizio che guida la pol II sul promotore dopo di che il fattore TFIIH permette alla pol II di accedere al punto di inizio sullo stampo di DNA. La trascrizione in una cellula eucariotica richiede un numero maggiore di proteine tra cui proteine regolatrici dette attivatori trascrizionali che legandosi a specifiche sequenze di DNA aiutano la pol II a posizionarsi sul punto iniziale della trascrizione. Per iniziare la trascrizione deve esistere un complesso poli proteico detto mediatore necessario a regolare le diverse proteine attivatrici richieste per questo processo.

15 Questi dati provengono da approfondite analisi fatte in vitro con un numero ristretto di proteine. La situazione in vivo si complica maggiormente in quanto serve un ulteriore complesso detto mediatore che permette alle proteine attivatrici di comunicare adeguatamente sia con le TFII che con la pol II. Inoltre, l inizio della trascrizione richiede il reclutamento di enzimi che modifichino la cromatina, compresi complessi di rimodellamento della cromatina e istone acetilasi. Una volta iniziata la trascrizione la pol II si muove a scatti fermandosi su alcune sequenze e accelerando su altre. Una volta che la pol II trascrive il DNA si associa con fattori di allungamento che la aiutano a mantenere la trascrizione e a non bloccarsi su nessuna sequenza.

16 Negli eucarioti la trascrizione rappresenta solamente un primo passaggio nella trasmissione dell informazione dal DNA alle proteine. Dopo che il filamento di RNA è stato trascritto viene sottoposto a modificazioni covalenti ad entrambe le estremità e alla rimozione delle sequenze introniche. Quest ultimo fenomeno si chiama splicing dell RNA messaggero. Questa modificazione permette inoltre di generare diverse proteine dallo stesso gene semplicemente modificando lo schema dello splicing! Le modificazioni dell estremità di una molecola di RNA riguardano l aggiunta di un cappuccio al 5 della molecola definito Cap e di una coda di poly A all estremità 3

17 Le estremità 5 e 3 di un RNA procariotico non sono modificate, mentre quelle che si trovano sull mrna eucariotico vengono modificate. Inoltre l RNA procariotico contiene molto spesso le istruzioni per codificare diverse proteine contemporaneamente. Mentre gli mrna eucariotici solitamente contengono l informazione per una sola proteina.

18 RNA pol II negli eucarioti Molti enzimi depuati a modificare l RNA nascente viaggiano sopra la RNA pol II, Per esempio ci sono proteinchinasi in grado di aggiungere più di cento gruppi fosfato, questi gruppi consentirebbero ad un numero selezionato di proteine di saltare a bordo della RNA pol II quando la trascrizione è avviata. Tra queste molecole spiccano le proteine destinate a modificare il 5 dell RNA nascente. Il cappuccio in 5 che viene messo alla molecola di RNA nascente è molto importante poiché permette di identificare questi RNA rispetto ad altri che svolgono funzioni diverse.

19 Non appena si sono prodotti i primi nucleotidi l mrna viene dotato di un cap attraverso una serie si tre modificazioni:1) una fosfatasi toglie il fosfato in 5. 2) una guanil transferasi attacca una GMP in modo inusuale ossia ) un a metil transferasi metila la G in posizione 7 sulla guanina. Nel nucleo questi cap sono associati ad un complesso proteico detto CBC. Anche le estremità 3 dei mrna sono modificate. Sulla coda della pol II viaggiano altri due complessi detti fattore di stimolazione del taglio (CStF) e fattore di specificità del taglio e della poliadenilazione (CPSF). Quando questo complessi trovano la sequenza adeguata sull RNA innescano altre proteine che per prima cosa tagliano il messaggero, quindi la poly-a polimerasi inizia a trasferire nucleotidi A alla catena di RNA. Dopo che l estremità 3 è stata tagliata la pol II continua ancora a valle la trascrizione del DNA. Presto però la pol II si stacca e questo RNA viene degradato. 5 Cap 3 polya

20 Splicing di un trascritto primario. L RNA messaggero viene prodotto nel nucleo cellulare, sul modello di un filamento di DNA, per mezzo di un enzima denominato RNA polimerasi DNA dipendente. Sempre nel nucleo, l mrna primitivo così costituitosi viene sottoposto ad un rimaneggiamento, detto splicing, che consiste essenzialmente nell eliminazione degli introni, privi di funzione codificante. L mrna maturo viene trasferito nel citoplasma e sistemato sui ribosomi dove viene letto.

21 Apparentemente la rimozione degli introni rappresenta un notevole sforzo energetico per la cellula eucariotica. Per spiegare l esistenza di questo notevole dispendio di energia, gli scienziati hanno ipotizzato che la presenza di una successione di esoni/introni possa facilitare la generazione di nuove proteine funzionali dagli stessi geni. Tutto questo permetterebbe di avere varianti proteiche nuove provenienti da sequenze codificanti di DNA comuni. Un esempio ci viene dalla α-tropomiosina che è soggetta a diversi schemi di splicing in cellule diverse.

22 Splicing dell RNA A differenza dei batteri dove le sequenze dei geni sono continue, negli eucarioti le sequenze che codificano i geni sono interrotte da sequenze intercalanti non codificanti dette Introni (scoperti nel 1977). Queste sequenze vengono rimosse dall RNA tramite una reazione detta splicing dell RNA. L RNA precursore dell RNA messaggero o detto premrna viene sottoposto a due reazioni sequenziali necessarie alla rimozione dell introne. Queste reazioni sono di trasferimento di fosfato o transesterificazione, esse rimuovono l introne come un cappio e congiungono le due estremità di un esone. Questo processo è molto complesso e richiede la presenza di sequenze di RNA addizionali e più di 50 proteine che idrolizzano molte molecole di ATP. Nel primo passaggio una A dell introne reagisce con il suo OH in 2 con il P della catena del DNA che gli sta a monte proprio al confine introne-esone. L estremità 5 dell introne si unisce covalentemente con questa A e si forma un cappio, successivamente i due esoni si avvicinano e si saldano tra loro.

23 Solo tre blocchi di sequenza sull Introne sono essenziale per la sua rimozione, il resto non essendo vincolato può essere occupato da qualsiasi nucleotide. In rosso è indicata la A che è fondamentale per dare via alla realizzazione del cappio. GU all inizio dell introne e AG alla fine sono doppiette invarianti, ossia presenti in tutti gli introni. Il resto delle basi è suscettibile a variazioni anche se le sequenze riportate nella figura sono quelle più facilmente trovate. Le distanze in nucleotidi tra il 5 ed il 3 dell introne sono le più disparate, si va da poche basi a migliaia!!

24 Il meccanismo di splicing Il complesso di piccoli RNA e proteine riconosce i segnali all inizio ed alla fine dell introne, avvicina le due estremità e possedendo attività enzimatica permette lo svolgimento delle reazioni di taglio dell Introne. Alcune molecole servono per riconoscere i punti in cui manovrare l introne, poi queste molecole cedono il passo ai piccoli RNA U1 e U2 che insieme al terzo piccolo RNA U6 producono una distorsione nel RNA necessaria ad avvicinare le due estremità dell introne. A questo punto una serie di reazioni enzimatiche si succedono a catena, portando all eliminazione dell introne. Anche se non sono indicate nella figura altre proteine entrano nel processo rendendolo particolarmente efficiente ed efficace.

25 Le molecole chiave dello splicing sono molecole di RNA dette snrna o piccoli RNA nucleari si chiamano U1, U2, U4, U5 e U6 si complessano con proteine per formare gli snrnp. Queste molecole riconoscono i confini Introne-Esone e partecipano alla chimica dello splicing. U1 riconosce il sito 5 e si scambia con U6 mentre BBP e poi U2 riconoscono il sito di ramificazione sull introne. U2 forza la A a disappaiarsi e la attiva per l attacco al sito di splicing in 5 dove avviene il primo trasferimento di fosfato. Il secondo avviene tra i due esoni che vengono avvicinati da U5. Tutti i riarrangiamenti e le reazioni che avvengono nello splicesoma richiedono l idrolisi di un gran numero di molecole di ATP.

26 Le modificazioni che partendo dal pre-mrna portano all mrna maturo avvengono nel nucleo della cellula. Una volta terminato lo splicing e le modificazioni al 5 e al 3 della molecola, l mrna deve essere trasferito nel citosol. Nel nucleo potrebbe confondersi con i resti dell RNA intronico che devono essere degradati. Il trasporto dell mrna è un processo molto selettivo che richiede l intervento delle proteine del poro nucleare. Sembrerebbe che per essere trasportato l mrna debba essere associato a proteine del cappuccio, ma soprattutto che proteine dette proteine ribonucleari nucleari eterogenee (hnrnp) si associno al pre mrna. Inoltre, è necessario che lo splicing sia stato completato ed infine che ci siano segnali adeguati sulla coda della molecola. Solo quando tutti questi segnali sono presenti l mrna può attraversare il complesso del poro nucleare ed entrare nel citosol.

27 .. ma alcuni RNA non servono per codificare proteine. Si tratta di RNA che possiedono funzioni alternative all interno della cellula. Gli RNA più abbondanti (80% dell RNA) sono quelli ribosomali che formano il nucleo del ribosoma necessario alla traduzione proteica. Questi rrna sono trascritti dall RNA pol I. Per ottenere un numero molto grande di rrna la cellula eucariotica possiede copie multiple dei geni che codificano per l rrna (circa 200 copie per genoma aploide nell uomo). Gli rrna non vengono cappati e poliadenilati. Ci sono quattro tipi di rrna negli eucarioti definiti dalla loro velocità di sedimentazione espressa in Svedberg. Gli rrna 18S, 5,8S e 28S sono prodotti dalla modificazione di un rrna precursore di grosse dimensioni, mentre l rrna 5S è prodotto dalla RNA pol III che trascrive un gene localizzato in una regione diversa del genoma. Lo svedberg (simbolo S) è un'unità di misura del tasso di sedimentazione che non fa parte del Sistema Internazionale. Uno svedberg, dimensionalmente uguale ad una unità di tempo, è pari a secondi. L'unità prende il nome dal fisico e chimico svedese Theodor Svedberg, vincitore del Premio Nobel per la chimica nel 1926 per il suo lavoro sulla chimica dei colloidi e l'invenzione dell'ultracentrifuga. Nell'ultracentrifugazione, il tasso di sedimentazione di una particolare macromolecola è calcolato dividendo la velocità di sedimentazione costante (espressa in m/s) per l'accelerazione applicata (espressa in m/s 2 ) e moltiplicando poi per

28 Il nucleolo è la più grande fabbrica di ribosomi della cellula. Si tratta di un grosso aggregato di macromolecole comprendenti gli stessi geni che codificano per gli rrna, i precursori degli rrna e le molecole mature situato nel nucleo ma non separato da menbrane. Inoltre contiene tutte le molecole che sono necessarie per la maturazione degli RNA ribosomali. I geni codificanti per l rrna sono distribuiti in 10 gruppi ciascuno disposto vicino alla punta di 5 coppie di cromosomi diversi. Quando la cellula entra in mitosi i cromosomi si condensano ed il nucleolo si distrugge. Dopo la mitosi la cromatina ritorna al suo stato naturale ed il nucleolo si riforma. Nucleolo

29 The nucleolus is a prominent sub-nuclear structure that is not bound by a membrane and resides within the nuclear matrix. Though known to exist since the eighteenth century, the primary function of the nucleolus was not discovered until the 1960s. It is now been determined that nucleoli manufacture the subunits that combine to form ribosomes, the cell's protein-producing factories. Accordingly, the size of nucleoli depends upon the ribosomal requirements of the type of cell in which they are found. In cells that produce large amounts of protein, and thus call for significant numbers of ribosomes, the size of the nucleolus is considerable, sometimes occupying as much as 25 percent of the total volume of the nucleus.

30 Summary 1. name(s): nucleolus 2. location: roughly in centre of nucleus. 3. appearance: approximately spherical but with an illdefined edge 4. size: about 1 micrometer in diameter 5. function: production of ribosomal components 6. Other RNAs are modified within nucleolus, for example trnas are modulated in this region of the nucleous

31 La traduzione negli eucarioti. La conversione dell informazione contenuta nell mrna in proteina viene definita traduzione. Poichè il DNA è scritto con un alfabeto fatto di quattro lettere mentre le proteine sono scritte con un alfabeto fatto da venti lettere Per questa ragione la sequenza nucleotidica di un messaggero deve essere tradotta in proteina seguendo determinate regole. Queste regole sono state decifrate negli anni 60 e rappresentano il codice genetico. Se l RNA e un polimero fatto di 4 lettere si potrebbe pensare che ciascun amminoacido possa essere codificato da una tripletta di tre lettere. In questo modo le possibili combinazioni sarebbero 4X4X4=64, ben maggiori delle venti combinazioni necessarie. Per questa ragione alcune triplette non dovrebbero essere usate o il codice genetico dovrebbe presentare un fenomeno di ridondanza, ossia diverse triplette dovrebbero codificare per lo stesso amminoacido. Ciascuna tripletta si chiama codone e rappresenta o un amminoacido o un segnale di stop al processo di traduzione.

32 Codone Nella traduzione proteica una sequenza di nucleotidi viene tradotta in in una sequenza di amminoacidi. In line di principio una sequenza di RNA può essere letta in ognuno dei tre quadri di lettura. Ovviamente ciò dipende dalla base scelta per la partenza, ma esiste un codice di punteggiatura che permette solo uno dei tre quadri di lettura

33 La tripletta codificante sull mrna non si lega direttamente all amminoacido ma ad una molecola adattatore che può riconoscere tramite un suo sito il codone e presentare all altra estremità l amminoacido. queste molecole si chiamano RNA transfer o trna e sono lunghe poco più di 80 nucleotidi e sono sintetizzati dalla RNA pol III. Queste molecole si ripiegano nello spazio in modo complesso ed assumono una forma a L. Una delle due estremità contiene l anticodone che riconosce il codone sull mrna mentre l atra estremità è usata per tenere legato l amminoacido. Ciascuna molecola di trna si lega ad uno dei 20 aa che rappresenta il suo partner ideale. L enzima che catalizza questa reazione è l amminoacil-trna sintetasi. Ovviamente per evitare errori il sistema possiede dei meccanismi di sicurezza che fanno si che ci siano meno di un errore ogni accoppiamenti.

34 Poiché il codice genetico è ridondante, ossia codoni diversi possono specificare per lo stesso amminoacido, bisogna che ci sia più di un trna per molti amminoacidi o che alcuni trna possano appaiarsi con più di un codone. In effetti si verificano entrambe le condizioni. Alcuni amminoacidi hanno più di un codone ed alcuni trna sono costruiti in modo da tollerare un appaiamento sbagliato in terza posizione. Questo appaiamento sbagliato spiega come mai ci siano tanti codoni alternativi per una stesso amminoacido che differiscono solamente in terza posizione. Gli esseri umani hanno 497 geni per i trna ma, fra di essi sono rappresentati solamente 48 diversi anticodoni.

35 Osservando la tabella si nota che i primi due aa sono vincolanti per specificare l aa, mentre il terzo può cambiare senza creare ambiguità nella scelta dell aa da inserire nella proteina nascente. Per esempio phe necessita di 2 U per essere inserita nella proteina, la terza base può essere una qualunque tra U, C, A o G che la scelta non verrà modificata.

36 Amminoacidi Gli amminoacidi che compaiono nelle proteine di tutti gli organismi viventi sono 20 (anche se evidenze recenti suggeriscono che questo numero potrebbe aumentare fino a 23, vedi più sotto) e sono sotto il controllo genetico, nel senso che l'informazione del tipo e della posizione di un amminoacido in una proteina è codificata nel DNA. Talvolta, nelle proteine compaiono anche altri amminoacidi, più rari, detti occasionali che vengono prodotti per modifiche chimiche successive alla biosintesi della proteina, che avviene sul ribosoma. In natura sono stati finora scoperti oltre 500 amminoacidi diversi che non fanno parte di proteine e svolgono ruoli biologici diversi. Alcuni sono stati addirittura trovati nelle meteoriti. Piante e batteri sono in grado di biosintetizzare amminoacidi particolari, che possono essere trovati, per esempio, negli antibiotici peptidici, ad esempio la nisina e l'alameticina L'acido 1-amminociclopropan- 1-carbossilico (ACC) è un semplice amminoacido ciclico disostituito che funge da intermedio nella sintesi dell'etilene, che per gli organismi vegetali è un ormone.

37 La reazione fondamentale durante la sintesi proteica è la formazione di un legame covalente tra un gruppo carbossilico all estremità di una catena polipeptidica in crescita e un gruppo amminico libero su di un amminoacido libero in arrivo.

38 Il messaggio dell RNA viene decodificato sui ribosomi dove avviene la sintesi proteica. Il ribosoma è una macchina molto complessa formata da più di 50 proteine e da alcune molecole di RNA ribosomale (che sono responsabile della sua struttura globulare e delle sue funzioni biologiche). Queste strutture sono edificate nel nucleolo e poi trasportate nel citosol dove espletano la loro funzione di macchine per la sintesi proteica. Il ribosoma è costituito da due subunità che normalmente non sono connesse tra loro. Una normale cellula eucariotica contiene milioni di ribosomi nel suo citosol. Alcuni sono liberi nel citosol, altri sono ancorati a membrane del reticolo endoplasmatico. membrana citoplasmatica golgi nucleo mitocondrio ribosomi

39 Siti di legame del ribosoma Ciascun ribosoma ha tre siti di legame per i trna (E, P e A), più unsito di legame per il mrna. I siti della sub-unità maggiore ingaggiano i trna e consentono alla catena polipeptidica di allungarsi man mano il ribosoma scorre l mrna.

40 Un ribosoma contiene quattro siti di legame: uno per il mrna e tre per i trna denominati siti A, P ed E. Un trna che porta un amminoacido nuovo da aggiungere alla catena si lega in A in modo che due trna siano ora adiacenti. L estremità carbossilica dell amminoacido situato sul trna in P si stacca tramite una reazione enzimatica dal suo trna e viene unita all estremità amminica dell amminoacido situato in A tramite una attività catalitica sdella subunità maggiore detta peptidil transferasi. Insieme a questo fenomeno i trna vengono spostati in E e P. Una serie di cambiamenti conformazionali sposta l mrna esattamente di tre nucleotidi in modo tale che il sito A sia di nuovo libero e pronto a ricevere un nuovo trna La fine del messaggio di codifica è fornita da tre codoni detti di stop. Questi codoni non hanno nessuna controparte su trna; ci sono fattori di rilascio che si legano a ciascun ribosoma in cui nel sito A ci sia un codone di stop

41 Quando la traduzione inizia le due subunità si assemblano sul mrna la subunità minore serve per far si che i trna si adattino ai codoni dell mrna mentre la subunità maggiore catalizza la formazione dei legami peptidici che uniscono gli amminoacidi dell proteina nascente. Infine quando il ribosoma incontra un segnale di stop rilascia la proteina e le due subuntà si staccano. Queste subunità possono essere usate in seguito per una nuova traduzione.

42 Il sito di inizio e quello di fine della traduzione rappresentano due aspetti fondamentali del processo di traduzione. La traduzione di un mrna inizia sempre dal codone AUG che codifica per un Metionina. Il codone AUG viene riconosciuto da un trna iniziatore che porta la Met, le met successive nella catena polipeptidica verranno portate da un trna diverso. Il trna iniziatore è l unico che si può legare in assenza di mrna alla subunità ribosomale minore insieme ai fattori di inizio eucariotici eif. Questi fattori si legano all mrna ed iniziano a scandagliare la molecola dal 5 cap in direzione 3 fino a che non incontrano un AUG. Quindi i fattori di inzio si dissociano la subunità maggiore si aggrega ed inizia la traduzione. Le sequnze a monte ed a valle dell AUG influenzano il ribosoma nella scelta del primo codone, nel 90% dei casi il primo AUG che il ribosoma incontra è quello da cui inizia la traduzione.

43 La fine del messaggio avviene quando il ribosoma incontra uno dei tre segnali di stop della traduzione: UAA; UAG; UGA che sono stati chiamati codoni di stop. Questi codoni non si appaiano ad un trna ma si legano a fattori detti di rilascio. Quando in posizione A entra un fattore di rilascio la peptidil transferasi è costretta a legare una molecola di acqua all ultimo amminoacido. Questa reazione libera l estremità della catena peptidica e il ribosoma si separa rilasciando l mrna.

44 La sintesi della proteine prevede inizi multipli da parte dei ribosomi su ciascuna molecola di mrna. Non appena il ribosoma ha tradotto una parte sufficiente di proteina l estremita 5 dell RNA viene nuovamente agganciata da un altro ribosoma. Le molecole di mrna si trovano nel citosol sotto forma di poliribosomi definiti anche polisomi che altro non sono che grossi complessi composti da parecchi ribosomi agganciati ad una molecola di mrna

45