Crescita batterica. Giovanni Di Bonaventura, Ph.D.

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1 Crescita batterica Giovanni Di Bonaventura, Ph.D. CI «Microbiologia e Microbiologia Clinica» CdS Medicina e Chirurgia Università G. d Annunzio, Chieti-Pescara AA

2 Crescita batterica fissione binaria

3 Crescita batterica divisione cellulare Durante la divisione, l aumento dei costituenti cellulari può tradursi in: aumento delle dimensioni cellulari microrganismi cenocitici: divisioni nucleari non accompagnate da divisioni cellulari (es. alghe, muffe) aumento del numero cellulare (es. batteri, lieviti, protozoi) Rhodophyta spp. (alga rossa) La Microbiologia generalmente studia la crescita di una popolazione, piuttosto che la crescita delle singole cellule Rhizopus spp (Zigomicete, muffa)

4 Cinetica della divisione cellulare La curva di crescita Osservata quando i microrganismi vengono coltivati in terreno liquido (brodo) Misura la variazione della quantità (massa totale o concentrazione) di batteri nel tempo: rappresentazione grafica di tipo semilogaritmica Log 10 (concentrazione cellulare espressa come CFU/ml, dove CFU= unità formanti colonie) vs tempo Si articola in 4 fasi (periodi), distinte e sequenziali

5 Fase di latenza (lag phase) Fase di adattamento metabolico: sintesi di nuovi enzimi per il metabolismo cellulare sintesi di nuovi componenti strutturali cellulari Numero cellulare costante; lieve aumento volumetrico Durata variabile (specie-specifica): in alcuni casi può essere di breve durata od assente

6 Fase esponenziale (log phase) Tutti i microrganismi sono in fase di riproduzione attiva (max velocità) gli eventi riproduttivi (di ciascuna cellula della popolazione) non avvengono nello stesso tempo (coltura non sincronizzata) Velocità di crescita costante nel tempo: aumento del numero cellulare aumento della massa cellulare totale Popolazione uniforme per proprietà chimico-fisiche Chiamata anche fase logaritmica

7 Fase stazionaria Numero totale di cellulare vitali rimane costante: Arresto della riproduzione Tasso riproduttivo controbilanciato dal tasso di mortalità (no aumento n cellulare) Metabolismo quasi quiescente (cryptic growth) Espressione di specifici geni di sopravvivenza Possibili cause: Raggiungimento di una densità critica di popolazione Accumulo dei cataboliti (azione tossica) Limitazione dei nutrienti Limitata disponibilità di O 2

8 Fase di morte (declino) Morte cellulare a velocità esponenziale Morte: perdita irreversibile della capacità di riprodursi lisi cellulare In alcuni casi, il tasso di mortalità rallenta a causa di un accumulo di cellule resistenti (viable but not culturable, VBNC)

9 Crescita batterica Modellizzazione matematica N t = N 0 x 2 n logn t = logn 0 + n x log2 logn t - logn 0 = n x log2 N t = N o x 2 t logn t = logn o + t n = logn t - logn 0 log2 n = 3.3 x (logn t - logn 0 ) N t = n. cellule al tempo t N o = n. cellule al tempo 0 n= n. generazioni al tempo t = n. generazioni nell unità di tempo (h) t = tempo trascorso

10 Tempo di generazione e velocità di crescita g = t/n = tempo di generazione (necessario perchè il numero cellulare raddoppi) k = n/t = velocità di crescita La pendenza (slope) della retta è diretta funzione della velocità di crescita

11 La gran parte dei batteri ha un tempo di generazione che oscilla tra 20 e 60 minuti, in condizioni ottimali (in vitro, in laboratorio). La maggior parte dei patogeni il tempo di generazione osservato nell ospite (in vivo, al sito di infezione) è maggiore, oscillando tra le 5 e le 10 h.

12 Crescita batterica Diamo i numeri Se si avviasse una coltura batterica contenente 10 cellule di Escherichia coli (N 0 =10), dopo 12 h di incubazione (t=12) avrebbero avuto luogo 36 generazioni (n=36; considerando un tempo di generazione medio di 20 min), ossia la popolazione batterica sarebbe composta da un numero Nt di cellule pari a: N t = N 0 x 2 n 12 h 10 x 2 36 = Nt = E. coli dopo 48 h di incubazione, il peso della popolazione risultante sarebbe volte maggiore quello della Terra!!! (una singola cellula pesa ~ 9.5 x g) Fortunatamente non accade! La crescita viene infatti limitata dalla mancanza di nutrienti essenziali e/o dalla produzione di cataboliti tossici. La popolazione entra nella fase stazionaria.

13 Log phase (fase esponenziale) Crescita bilanciata Durante tale fase le cellule esibiscono una crescita bilanciata: i costituenti cellulari vengono sintetizzati a velocità costante ed in maniera congiunta Di contro, si osserva crescita non bilanciata, quando: modificazione del livello dei nutrienti - shift-up (terreno "povero terreno ricco ) - shift-down (terreno ricco terreno povero ) modificazioni delle condizioni ambientali Concentrazione di nutrienti vs crescita

14 Colture continue Chemostato Coltura vecchia (in fase stazionaria) Coltura giovane (in fase logaritmica) Necessità di un modello che riproduca fedelmente la situazione in vivo Chemostato, consente il controllo indipendente di velocità di crescita e densità cellulare: velocità del terreno in ingresso = velocità del terreno in uscita nutriente essenziale in quantità limitanti incremento costante del numero cellulare e della massa batterica

15 Coltura sincronizzata vs non sincronizzata Escherichia coli (t gen = 20 min) Coltura non sincronizzata: ogni cellula si riproduce a tempi LEGGERMENTE DIFFERENTI. La curva ha andamento lineare. Coltura sincronizzata: ogni cellula si riproduce allo STESSO tempo. La curva ha andamento a scala (altezza di un gradino è 2x quella del gradino precedente)

16 Tecniche per la determinazione della dimensione di una popolazione cellulare Conta diretta cellulare Conteggio in camera contaglobuli Contatori elettronici Filtrazione su membrana Conta vitale cellulare Metodo della semina su terreno agarizzato Metodo di filtrazione su membrana

17 Conteggio mediante contaglobuli Semplice, economico e veloce Adatto per la conta di eucarioti e procarioti Limitazioni: NON fornisce informazioni sulla vitalità cellulare scarsa precisione disponibilità di un microscopio ottico scarsa sensiblità ( 10 6 cells/ml)

18 Contatori elettronici Passaggio forzato della sospensione microbica attraverso un orifizio di piccole dimensioni Il batterio viene investito da una corrente elettrica applicata all orifizio Conteggio degli eventi interruzione della corrente elettrica Veloce e di semplice esecuzione Adatto per microrganismi di dimensioni rilevanti e per cellule ematiche Limitazioni: NON distingue le cellule vive dalle morte

19 Conta vitale cellulare Determina il numero di cellule vitali La dimensione di popolazione viene espressa come unità formanti colonie (UFC; oppure CFU: colony-forming units)

20 Conta vitale cellulare Diluizioni seriali (10-fold) del campione Semina (su terreno solido) delle diluizioni del campione Incubazione (37 C, 24h) Conteggio del numero di colonie (UFC) Calcolo n cellule nella popolazione UFC/ml = n UFC x fattore diluizione

21 Metodo delle membrane filtranti Particolarmente adatto per l analisi dei campioni ambientali

22 Misura della massa cellulare Peso secco tempi lunghi scarsamente sensibile Quantità di un particolare costituente cellulare proteina, DNA o ATP adeguato se la quantità del target è costante in ogni cellula Misurazione turbidimetrica (light scattering) comune impiego veloce, semplice e sensibile

23 Misurazione turbidimetrica La densità ottica è la quantità di luce in grado di passare attraverso la sospensione batterica. Principio: tanto maggiore sarà il numero cellulare, tanto più densa (opaca) sarà la coltura. Questo significa che, in presenza di crescita batterica, una quantità minore di luce sarà in grado di passare attraverso il campione, a causa della torbidità della sospensione cellulare.

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