Determinazioni quantitative in farmacologia

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1 Determinazioni quantitative in farmacologia 1

2 Dosaggio biologico determinazione quantitativa della concentrazione o della potenza di una sostanza per mezzo della valutazione della risposta biologica che essa determina 1. Per determinare quantitativamente l attività farmacologica di sostanze 2. Per determinare quantitativamente la concentrazione di sostanze note 3. Per studiare l azione di mediatori endogeni 4. Per determinare quantitativamente la tossicità dei farmaci Confronto con standard di riferimento Curva dose-risposta Valutazione della risposta: quantale o graduale 2

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4 Una particolare determinazione quantitativa: il dosaggio delle proteine 4

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6 Legge di Lambert-Beer un fascio di luce di intensità I 0 attraversa uno spessore l di una soluzione a concentrazione c e ne emerge con intensità I 1. A = -log 10 T = c l l in cm c in M ελ= coeff di assorbanza A 2 1 E una legge monocromatica Soluzioni diluite: M 0 concentrazione 6

7 Determinazione della concentrazione totale di proteine in un campione Misura diretta a 280 nm Aminoacidi aromatici Misura diretta a 205 o 220 nm Legame peptidico Metodi indiretti (colorimetrici) Biureto Folin-Lowry Acido bicinconinico Bradford (blu Coomassie G-250) 7

8 1. Misura dell assorbanza intriseca UV [sensibilità scarsa: mg/ml] Richiede una proteina pura Sostanze che assorbono in UV sono interferenti (DMSO, detergenti,.) Il calcolo è approssimato (no quantitativo) (Cuvette di 1 cm) [Protein] (mg/ml) = 1.55xA xA 260 [Protein] (mg/ml) = A 280 [Protein] (mg/ml) = A 280 / ελ Layne: Methods in Enzymology 3: 447 (1957) 8

9 Assorbimento Spettro di assorbimento UV-VIS di una proteina Picco di assorbimento di Tirosine, Triptofani e Fenilalanine Lunghezza d onda λ (nm) UV = 200 nm 350 nm

10 2. Lowry assay [ μg] Si basa sulla riduzione del Cu 2+ a Cu + in condizioni alcaline in tartrato di Na + e K + Più accurato del precedente Richiedono una preparazione piuttosto lunga, con lunga incubazione a T alte Possono interferire molte sostanze (lipidi, detergenti, agenti riducenti, ecc.) Lowry et al.: J.Biol.Chem. 193: 265 (1951) 10

11 Lowry assay 1) Formazione di complessi di Cu(II) e riduzione a Cu(I) da parte di a.a. aromatici in presenza di tartrato 2) Riduzione di fosfomolibdotungstato (giallo, reattivo di Folin-Ciocalteau) da parte di Cu(I) colore blu 11

12 3. Biuret assay [1 mg] In condizioni alcaline le sostanze che contengono due o più legami peptidici formano un complesso con i sali di rame in soluzione Metodo accurato Preparazione ad un solo step La reazione avviene a T ambiente Aminoacidi con gruppi aromatici possono interferire Layne: Methods in Enzymology 10:447 (1957) 12

13 Biuret assay 13

14 Biuret assay Complesso Rame-Proteina in ambiente basico: nm 14

15 Perché si misura al picco di assorbimento? 15

16 4. BCA assay (bincinchoninic acid) [< 0.5 g/ml] Simile al Lowry, dipende dalla conversione di Cu ++ in Cu + in condizioni alcaline che viene poi rilevato mediante reazione con il BCA per ottenere un color porpora letto a 562 nm. E più sensibile rispetto al Lowry e più tollerante per la presenza di altri composti. Stoscheck: Methods in Enzymology 182:50 (1990) 16

17 5. Bradford assay [2-20 μg/ml] Si basa sull equilibrio fra tre forme di coomassie blue G 250 In ambiente acido è stabile la forma protonata (rossa) Dopo il legame alle proteine è più stabile la forma non protonata (blù) Metodo veloce, pochi passaggi, T ambiente, risposta colorimetrica stabile Bradford: Anal.Biochem. 72:248 (1976) 17

18 Bradford assay Cation Neutral form Anion 470 nm (red) 650 nm (green) 595 nm (blue) Formazione di complessi tra proteine ed il coomassie G250 si forma un prodotto colorato che assorbe a 595nm 18

19 Bradford assay 19

20 Bradford assay Commenti Si può aggiungere NaOH 1 M per aumentare la solubilizzazione delle proteine I volumi possono essere ridotti La retta di taratura può essere curva Il reagente colora le cuvette ed è piuttosto difficile da rimuovere La quantità di colorante che si lega alla proteina dipende dal contenuto in aminoacidi basici ciò rende difficile la scelta di uno standard 20

21 Bradford assay Bovine serum albumin Bovine gamma globulin 21

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23 Curve standard (Quick Guide) Le curve standard non sono sempre lineari Le curve standard possono essere lineari in un preciso intervallo La scelta del tipo di proteina da utilizzare per la curva standard deve avere un senso Devi essere sicuro che la tua curva standard copra un range di assorbanza nel quale si troverà il tuo campione incognito (almeno due punti sopra e due sotto) Se la preparazione di proteine da dosare contiene sali, tamponi particolari ed altro, usa lo stesso tampone per fare il bianco e gli standard 23

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25 Alcune note Soluzioni calde.. Soluzioni fredde. Soluzioni troppo concentrate..

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