La variabilità genetica: tipi e metodi per studiarla e misurarla

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1 La variabilità genetica: tipi e metodi per studiarla e misurarla

2 La variabilità genetica (V.G.) 1. V.G. somatica 2. V.G. gametica intraindividuo 3. V.G. gametica intrapopolazione (polimorfismo) 4. V.G. gametica interpopolazione 5. V.G. interspecie (filogenetica)

3 Variabilità Percentuale di siti che mutano rispetto al totale nel confronto pairwise (confronto a coppie) 1. Genoma Umano nucleare: mediamente 0,1%. 2. Genoma Umano mitocondriale: mediamente 0,3%. Variabilità media : n. di siti varianti, rispetto al numero di siti totali costituenti il genoma, osservati in un gruppo di individui: Variabilità media nucleare umana: 1. 10MSNPs/3000Msiti = 0,3% 2. Variabilità media mitocondriale : 3466SNPs/16570siti= 21% su 2150 genomi mt umani

4 Come si può presentare la variabilità genetica e quale tipo è utile per quali tipi di studi

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6 Variabilità è un termine a cui è associata una enormità di problematiche scientifiche e culturali. Variabilità inter-specie Variabilità intra-specie In questa lezione verrà posta l enfasi sulla variabilità intra-specie umana (human diversity)

7 Tipi di polimorfismo Caratteristiche fenotipiche alternative Polimorfismi biochimici Polimorfismi anonimi o del DNA In genetica di popolazione un locus è semplicemente una posizione nel genoma per cui anche una singola base può essere un utile locus polimorfico

8 Uno sguardo d insieme ad una regione cromosomica G

9 1. RFLPs Restriction Fragment Lenght Polymorphism (biallelic).tipizzabili mediante PCR or Southern based screening. Studi di associazione. 2. SNPs Single Nucleotide Polymorphism (bi-allelic) Più di 10 6 loci tipizzabili mediante arrays. Studi di associazione anche per eredità quantitativa QTL. 3. Minisatelliti (Jeffreys 1987) o VNTRs Variable Number of Tandem Repeat (multiple allelic system) sono lunghi da nucleotidi e sono ripetuti volte. Più di 10 4 loci. Il loro screening si fonda sul Southern blot. Diagnostica forense. 4. I Microsatelliti STRPs Short Tandem Repeats (multiple allelic system) sono lunghi da 2-6 nucleotidi e sono organizzati in tandem da 5 a 30 copie. Più di 10 5 loci. Tipizzabili mediante PCR. Studi di associazione anche QTL e diagnostica forense. 5. Indels 6. Transposable elements

10 Identificazione e tipizzazione di polimorfismi Alu Identificazione: ricerca in database di elementi Alu giovani (famiglia Alu Y), che hanno una più elevata probabilità di essere stati trasposti durante l evoluzione umana e quindi di essere polimorfici (presenza o meno in un dato locus). Tipizzazione: tramite PCR, con primers che fiancheggiano il sito di inserzione ed elettroforesi su gel d agarosio. Sono i polimorfismi più facili da analizzare

11 Identificazione e tipizzazione di polimorfismi LINE1 Identificazione: ricerca in database di elementi LINE1 giovani (famiglia Ta), che hanno una più elevata probabilità di essere stati trasposti durante l evoluzione umana e quindi di essere polimorfici. Tipizzazione: tramite PCR (vedi figura).

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13 LA VARIABILITA GENOMICA COME APPLICAZIONE A. APPLICAZIONI BASATE SUL LINKAGE MAPPATURA GENICA MEDIANTE ANALISI DEL LINKAGE NELLE FAMIGLIE MAPPATURA GENICA MEDIANTE ANALISI DEL LINKAGE A LIVELLO DI POPOLAZIONI (LINKAGE DISEQUILIBRIUM MAPPING) DIAGNOSI PRENATALE B.GENETICA FORENSE IDENTIFICAZIONE PERSONALE PATERNITA INCERTA C. STUDI SULL EVOLUZIONE INTERSPECIE INTERPOPOLAZIONI DNA antico

14 Lo sviluppo dei marcatori genetici umani Tipo di marcatore n loci n alleli Gruppi sanguigni 20 3 (AB0) Varianti seriche 30 DNA RFLPs > DNA VNTRs minisat > 10 4? DNA STRPs microsat > 10 4? SNPs >

15 Lunghezza dei repeats vs copy number

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17 RFLP and Southern blot detection

18 Identificazione di RFLP attraverso Southern blot

19 Mini e microsatelliti

20 Mini e microsatelliti

21 I minisatelliti hanno una comune sequenza core 5'-TTAGGG-3 (telomerico) oppure GGGCGGAXG, dove X può essere qualunque nucleotide. Raramente sono espressi ma sono hot spot di ricombinazione omologa

22 Sequenza comune a molti loci dispersi nel genoma

23 MINISATELLITI Variabilità inter-individuale dovuta al numero di ripetizioni in tandem Un locus 1 Un altro locus 2 3 Un altro locus

24 Tipizzazione di genomi individuali mediante minisatelliti Data la lunghezza dei minisatelliti, non sempre è possibile amplificarli mediante PCR, ed in alcuni casi si utilizza il southern blotting. In questo caso, dopo analisi di restrizione, si utilizza spesso una sonda che riconosce un motivo core comune a più minisatelliti, e che permette di evidenziare più minisatelliti contemporaneamente (ma senza conoscere la loro identità)

25 Fingerprint del DNA Test di appartenenza familiare test di paternità test per casi di violenza sessuale

26 ESTRAZIONE DIFFERENZIALE DEL DNA FEMMINILE E MASCHILE

27 Digested Hinf 1 Un caso di paternità risolta fra cavalli da corsa Sonda S05

28 I microsatelliti STRs I microsatelliti sono altamente polimorfici e sono costituiti da ripetizioni di singole Adenine o Timine o ripetizioni del dinucleotide CA. Ripetizioni di triplette in una regione di DNA codificante sono spesso siti predisposti ad espansione che può essere patogenica (Huntinghton).

29 I microsatelliti possono essere perfetti, interrotti o composti e vengono ulteriormente classificati in base alla lunghezza del motivo ripetuto (dinucleotide repeats, trinucleotide repeats ecc..) o se sono o non sono patogenici.

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31 Microsatelliti amplificati con PCR multiplex e analizzati con sequenziatore

32 PCR MULTIPLEX

33 Sistemi di indagine automatizzati

34 Microsatelliti analizzati con sequenziatore

35 Tasso di mutazione I differenti tipi di polimorfismi differiscono circa il loro tasso di mutazione per diversi ordini di grandezza

36 Single Nucleotide Polymorphism (SNP) SNP Tasso di mutazione :10-8 /10-9 /locus/generazione Microsatelliti Tasso di muatazione 10-3 /10-4 /locus/generazione

37 SNPs

38 Il dinucleotide CpG è un hotspot di mutazione

39 MICROSATELLITI Tasso di mutazione molto elevato La mutazione avviene generalmente per aumento o diminuzione di una singola unità ripetitiva Le Mutazioni per aumento di una unità ripetitiva sono più frequenti di mutazioni per diminuzione Il tasso di mutazione per ciascun microsatellite è correlato con la lunghezza dell allele

40 A quali meccanismi si deve questo alto tasso mutazionale?

41 and homologous recombination mispairing

42 * SNPs SNPs hanno solo 2 alleli e quelli polimorfici (frequenza maggiore del 5%) sono presenti, nel genoma umano, ogni basi. Possono o no essere associati ad un fenotipo osservabile. SNP detection= Discovery panel ossia 48 individui provenienti da popolazioni di tutto il mondo, sequenziamento parziale del genoma e identificazione di SNPs.

43 Discovery panel: a sample for sequencing Screening/Genotyping Genoma di un singolo individuo

44 La maggior parte degli SNPs è neutrale ma in alcuni casi si ha effetto sull espressione dei geni