LA SEPSI: ANTIBIOGRAMMA E LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA. Francesco Luzzaro Laboratorio di Microbiologia e Virologia

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1 LA SEPSI: ANTIBIOGRAMMA E LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA Francesco Luzzaro Laboratorio di Microbiologia e Virologia

2 Diagnostica microbiologica: prelevare al più presto 2 o più emocolture (prima di cominciare la terapia antibiotica) insieme a colture eseguite a partire da altri siti secondo le indicazioni cliniche

3 Ricerca della fonte settica: uno specifico sito di infezione dovrebbe essere stabilito il più rapidamente possibile (entro le prime 6 ore di presentazione)

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5 Gram-negativi non fermentanti e carbapenemi P. aeruginosa (COS) A. baumannii (CRAB) Antibiotico MIC mg/l (S/I/R) Antibiotico MIC mg/l (S/I/R) Pip-Tazo > 16 (R) Ceftazidime > 8 (R) Cefepime > 8 (R) Aztreonam > 1 (R) Imipenem > 8 (R) Meropenem > 8 (R) Amikacina > 16 (R) Gentamicina > 4 (R) Ciprofloxacina > 1 (R) Colistina 2 (S) Imipenem > 16 (R) Meropenem > 16 (R) Doripenem > 8 (R) Amikacina > 32 (R) Gentamicina > 16 (R) Tobramicina > 16 (R) Ciprofloxacina > 4 (R) Colistina 2 (S) Tigeciclina 2 Amp-sulbactam 16

6 EMOCOLTURE: DIAGRAMMA DI FLUSSO Paziente settico Mediamente 96 h Risultato finale Esecuzione dei prelievi Invio al laboratorio Identificazione ed antibiogramma Crescita su piastra Incubazione delle bottiglie 100 Semina su terreno % Positive samples BACTEC 9240 BacT/Alert Incubation time (hrs) Emocoltura positiva Colorazione di Gram Mediamente 48 h prima del risultato diagnostico

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8 Esame microscopico (colorazione di Gram)

9 Identificazione dei batteri nella routine del Laboratorio di Microbiologia

10 MALDI-TOF Il sistema è costituito da Sorgente (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Analizzatore (Time Of Flight) PC Fornisce accurate informazioni su struttura e peso molecolare di biomolecole: peptidi proteine oligonucleotidi carboidrati polimeri sintetici ID microbica rapida (pochi minuti)

11 VITEK MS: IDENTIFICAZIONE CON TECNOLOGIA MALDI-TOF

12 Identificazione da colonia mediante spettrometria di massa

13 Chiusura del vuoto Principio del MALDI-TOF-MS Sistema sotto vuoto Piastra del Griglie di accelerazione campione Molecole di analita immerse nella matrice Tubo di volo Spettro di Massa Rilevatore di Ioni Lo spettro di massa riflette essenzialmente le molecole di analita

14 Profilo MALDI Identificazione basata su proteine ribosomiali Spettri di massa specifici per famiglia, genere e specie Intens. [a.u.] ribosomal Protein m/z RL ,33 RS ,82 RL ,39 RL33meth. 6255,39 RL ,19 RL ,60 RL ,74 RL ,45 RL ,06 RS , m/z Escherichia coli

15 Tempo per l identificazione di specie ridotto di 28.8 h Terapia inappropriata dopo 24 h: 4.5% (-10.1%) Appropriato trattamento antibiotico entro 24 h: 75.3% (+11.3%)

16 Analisi diretta degli estratti batterici mediante MALDI-TOF Staphylococcus aureus resistente alla meticillina (MRSA) Produzione di beta-lattamasi (ESBL, MBL, KPC) Enterococcus faecalis/faecium resistente alla vancomicina (VRE)

17 Escherichia coli ß-lattamasi-negativo Escherichia coli ß-lattamasi-positivo Escherichia coli ß-lattamasi-positivo dopo aggiunta di acido clavulanico Prodotti di idrolisi dell ampicillina

18 Isolato produttore di carbapenemasi (KPC): recupero della sensibilità dopo aggiunta di acido boronico S KPC KPC + AB

19 ] ] Isolato produttore di carbapenemasi (MBL): recupero della sensibilità dopo aggiunta di EDTA Intens. [a.u.] x ceppo1a 0:G2 MS R aw S Intens. [a.u.] x Intens. [a.u.] 0.0 x ceppo1b 0:H2 MS R aw ceppo2a 0:C 4 MS R aw MBL Intens. [a.u.] 0.0 x Intens. [a.u.] 0.0 x ceppo2b 0:D4 MS R aw MBL + EDTA Intens. [a.u.] 0.0 x x10 4 ceppo3b 0:H4 MS R aw u.] x10 4 MixB 0 :D 2 MS R a w

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21 Antibiogramma diretto: Staphylococcus aureus Isolato resistente alla meticillina (MRSA)

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23 Antibiogramma diretto: Escherichia coli Isolato produttore di ESBL (CTX-M-15)

24 Escherichia coli produttore di ESBL < 10% 10-15% 16-20% > 20% Tot. isolati: 1278 Tot. testati: 555 ESBL-pos.: 15.1% STUDIO OASIS

25 Klebsiella pneumoniae produttore di ESBL < 10% 10-30% 31-50% > 50% Tot. isolati: 552 Tot. testati: 258 ESBL-pos.: 26.7% STUDIO OASIS

26 Proteus mirabilis produttore di ESBL < 15% 15-30% 31-50% > 50% Tot. isolati: 204 Tot. testati: 152 ESBL-pos.: 32.2% STUDIO OASIS

27 Enterobatteri e beta-lattamici I breakpoint per cefalosporine ed aztreonam sono in grado di rilevare tutti i meccanismi di resistenza clinicamente importanti (incluse ESBL e AmpC mediate da plasmidi). Alcuni isolati produttori di beta-lattamasi sono sensibili o intermedi alle cefalosporine di 3 o 4 generazione con questi breakpoints e dovrebbero essere riportati SENZA MODIFICARE LA CATEGORIA INTERPRETATIVA In molte aree, la rilevazione e la caratterizzazione delle ESBL è raccomandata o obbligatoria per scopi di controllo delle infezioni.

28 E consigliabile continuare a ricercare la produzione di ESBL con i metodi convenzionali o con i sistemi automatici in tutti gli isolati di enterobatteri clinicamente significativi In caso di positività del test, l interpretazione categorica della sensibilità alle cefalosporine a spettro esteso non sarà modificata ma si raccomanda di segnalare nel referto, mediante apposita nota esplicativa, la presenza del meccanismo di resistenza e le possibili implicazioni cliniche ed epidemiologiche

29 Antibiogramma diretto: Klebsiella pneumoniae Isolato produttore di carbapenemasi (KPC)

30 Il laboratorio deve comunicare tempestivamente al reparto il sospetto di presenza di batteri produttori di carbapenemasi in modo da consentire l instaurarsi di misure di isolamento da contatto Il paziente infetto va collocato in una stanza singola Se la stanza singola non fosse disponibile, andrà individuata un area delimitata all interno di una stanza In caso di più pazienti infetti è possibile effettuare l isolamento per coorte

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32 Enterobatteri e carbapenemi I breakpoint per i carbapenemi sono in grado di rilevare tutti i meccanismi di resistenza clinicamente importanti (inclusa la maggior parte delle carbapenemasi). Alcuni isolati produttori di carbapenemasi sono sensibili con questi breakpoints e dovrebbero essere riportati SENZA MODIFICARE LA CATEGORIA INTERPRETATIVA In molte aree, la rilevazione e la caratterizzazione delle carbapenemasi è raccomandata o obbligatoria per scopi di controllo delle infezioni.

33 Klebsiella pneumoniae resistente ai carbapenemi % 52% 15.2% 49% Rimini, Pavia, 98 novembre febbraio

34 Klebsiella pneumoniae resistente ai carbapenemi EARS-NET 2011 Italia: 26.7% Figura 4.12

35 Comitato di Studio per gli Antimicrobici Studio carbapenemasi 25 Centri (2011) Coordinatori: F. Luzzaro L. Pagani G.M. Rossolini Maggio Giugno 2011 Resistenza ai carbapenemi confermata mediante test fenotipici e molecolari in 270 enterobatteri isolati in 23/25 Centri ospedalieri

36 Enterobatteri resistenti ai carbapenemi (Totale isolati, n=270/13749) 86.7% K. pneumoniae 5.6% E. cloacae 2.2% 1.9% 1.9% 0.7% K. pneumoniae E. cloacae E. aerogenes E. coli S. marcescens H. alvei C. freundii K. oxytoca P. mirabilis Sorveglianza nazionale 2011

37 Meccanismi di resistenza ai carbapenemi in Klebsiella pneumoniae (n=234) 87.2% KPC-type 6.8% MBL 1.7% 4.3% KPC MBL Perdita di porine OXA-48 Sorveglianza nazionale 2011

38 KPC MBL Isolati di Klebsiella pneumoniae produttore di KPC in 21/25 Centri Isolati di Klebsiella pneumoniae produttore di MBL in 6/25 Centri Sorveglianza nazionale 2011

39 Klebsiella pneumoniae produttore di KPC (n=204) 21.2% 38.2% Area chirurgica Area critica 32% Area medica Ambulatorio Area medica Area critica RSA Area chirurgica Area riabilitativa 2.9% 2.9% 2.9% Sorveglianza nazionale 2011

40 Emocolture: algoritmo operativo EMOCOLTURA GRAM ISOLAMENTO IDENTIFICAZIONE E ANTIBIOGRAMMA h h h TERAPIA EMPIRICA TERAPIA MIRATA TERAPIA OTTIMALE

41 Grazie per l attenzione! Francesco Luzzaro Laboratorio di Microbiologia e Virologia Azienda Ospedaliera della Provincia di Lecco