SAPIENZA Università di Roma Laurea magistrale in Ingegneria delle Nanotecnologie A.A Corso di Laboratorio di Biofotonica

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1 SAPIENZA Università di Roma Laurea magistrale in Ingegneria delle Nanotecnologie A.A Corso di Laboratorio di Biofotonica Prof. Francesco Michelotti SAPIENZA Università di Roma Facoltà di Ingegneria Civile e Industriale francesco.michelotti@uniroma1.it

2 Applicazioni dell ottica e della fotonica Tecniche Microscopiche (MSC) Fluorescenza convenzionale TIRF FLIM FRET, FRAP confocale a due fotoni di seconda armonica a super-risoluzione (SNOM, STED, PALM, STORM) Tecniche Non Microscopiche Label-free Surface plasmon Polaritons (SPP) Photonic crystals (PC) Raman e CARS Quantum dots Tecniche Non Microscopiche Citofluorimetria ELISA DNA-Chip Cycle-sequencing SOLID Altre Tecniche Non Microscopiche Southern Western Northern Utilizzano tutte l emissione di marcatori (labels) luminescenti

3 LEZIONE 2 Cenni alla struttura elettronica delle molecole organiche e Spettroscopia di assorbimento della radiazione elettromagnetica

4 Applicazioni di ottica e fotonica L utilizzo di sostanze coloranti per marcare materiali biologici è alla base di quasi tutte le tecniche elencate. Esempio Microscopia convenzionale su tessuti colorati Eosina: citoplasma Ematossilina: nuclei

5 Applicazioni di ottica e fotonica L utilizzo di sostanze coloranti per marcare materiali biologici è alla base di quasi tutte le tecniche elencate. Esempio Microscopia di fluorescenza su cellule marcate con molecole fluorescenti Cellule endoteliali marcate con molecole fluorescenti che attaccano selettivamente alcune parti cellulari Rosso Verde Blu Mitocondri Citoscheletro di F-actina Nucleo

6 Applicazioni di ottica e fotonica L utilizzo di sostanze coloranti per marcare materiali biologici è alla base di quasi tutte le tecniche elencate. Esempio Microscopia confocale su cellule marcate con molecole fluorescenti Microscopia di fluorescenza convenzionale Microscopia confocale Midollo umano Muscolo di coniglio Polline di Girasole

7 Applicazioni di ottica e fotonica L utilizzo di sostanze coloranti per marcare materiali biologici è alla base di quasi tutte le tecniche elencate. Esempio Microscopie di fluorescenza a super risoluzione Confronto Confocale STED Confronto Fluorescenza PALM

8 Applicazioni dell ottica e della fotonica Generalmente i coloranti utilizzati per marcare tessuti, cellule o frammenti di DNA sono costituiti da molecole organiche. Di conseguenza la parte iniziale del corso sarà dedicata ai meccanismi con i quali un sistema molecolare assorbe ed emette radiazione luminosa. Al termine del corso si daranno anche dei cenni alle proprietà di assorbimento ed emissione di nanoparticelle metalliche o semiconduttrici.

9 Generalità sullo schema dei livelli di molecole organiche Le molecole sono formate da nuclei ed elettroni. Esse sono caratterizzate da stati energetici quantizzati associati al moto e alle interazioni delle cariche e ai loro movimenti di vibrazione e rotazione nello spazio. Si hanno quindi contributi di natura elettronica, vibrazionale, rotazionale e di spin all energia dei livelli. Ad ogni stato è associata un energia che è approssimativamente data dalla somma dei singoli contributi: con E mol E el + E vib + E rot + E spin E el > E vib > E rot > E spin

10 Energia Generalità sullo schema dei livelli di molecole organiche eccitato v =2 v =1 v =0 v=1 J =3 J =2 J =1 J =0 riposo v=2 v=1 v=0 v=0 J=3 J=2 J=1 J=0 Transizioni elettroniche E el 2 3 ev vibrazionali E vib mev rotazionali E rot mev di spin E spin mev 1 ev= J= 8065 cm -1

11 Interazione lineare tra molecole organiche e radiazione e.m. La transizione tra due livelli energetici può essere associata all assorbimento/emissione di un fotone di energia pari alla differenza di energia tra i due livelli: hn= DE= E 2 -E 1 Esistono tre processi lineari di interazione fondamentali : hn hn hn hn hn Assorbimento Emissione spontanea Emissione stimolata In approssimazione di dipolo non tutte le transizioni sono possibili ma valgono delle Regole di Selezione

12 Interazione lineare tra molecole organiche e radiazione e.m. SPIN ROT VIB EL FOTODISSOCIAZIONE

13 Interazione lineare tra molecole organiche e radiazione e.m. PARETE La transizione tra due livelli energetici può avvenire anche senza assorbimento/emissione di un fotone. k B T Temperatura Urto k B T Per questi processi non vale alcuna regola di sezione

14 Ulteriori considerazioni sui livelli di molecole organiche Il diagramma dei livelli della molecola dipende da quelli dei costituenti atomici. Molecole biatomiche omonucleari: caso H 2 H H 2 2s* H Antilegame (antibonding) 1s 1s 1s Energia di interazione: Legame (bonding) gerate simmetrico ungerate antisimmetrico Repulsione coulombiana tra nuclei Repulsione coulombiana tra elettroni Attrazione coulombiana tra elettroni e nuclei L energia dei livelli dipende dalla distanza internucleare R (curve di Morse)

15 Ulteriori considerazioni sui livelli di molecole organiche Molecole biatomiche omonucleari: caso He 2 He 1s He 2 2s* He 1s La somma delle energie degli elettroni negli orbitali di legame ed antilegame è maggiore delle energie dei due atomi separati. 1s La molecola di He 2 non è quindi stabile e non si forma.

16 Ulteriori considerazioni sui livelli di molecole organiche Molecole biatomiche omonucleari: caso O 2 e F 2 O 2p O 2 4s* 2p* 1p O 2p Gli orbitali appartenenti alle shell interne non si combinano Si combinano solo orbitali di pari energia 3s Si combinano a coppie solo orbitali con uguale simmetria 2s 2s* 1s 2s Nel caso di O 2 e F 2 gli orbitali atomici 2s e 2p non si mescolano

17 Ulteriori considerazioni sui livelli di molecole organiche Molecole biatomiche omonucleari: caso O 2 e F 2 F 2p F 2 4s* 2p* 1p F 2p Gli orbitali appartenenti alle shell interne non si combinano Si combinano solo orbitali di pari energia 3s Si combinano a coppie solo orbitali con uguale simmetria 2s 2s* 1s 2s Nel caso di O 2 e F 2 gli orbitali atomici 2s e 2p non si mescolano

18 Ulteriori considerazioni sui livelli di molecole organiche Molecole biatomiche omonucleari: caso Li 2,Be 2, B 2, C 2, N 2 N 2p 4s* 2p* 3s 1p N 2 N 2p Gli orbitali appartenenti alle shell interne non si combinano Si combinano solo orbitali di pari energia Si combinano a coppie solo orbitali con uguale simmetria 2s 2s* 1s 2s In questo caso gli orbitali atomici 2s e 2p si mescolano

19 Ulteriori considerazioni sui livelli di molecole organiche Molecole biatomiche eteronucleari: caso HF H 1s s* HF F Si considerano solo gli orbitali atomici del guscio più esterno, quindi 1s per l idrogeno e 2p x per il fluoro. 2p x Si ottengono due orbitali molecolari di tipo s, uno di legame ed uno di antilegame s

20 Ulteriori considerazioni sui livelli di molecole organiche Molecole poliatomiche Per le molecole poliatomiche eteronucleari i livelli si costruiscono nello stesso modo che in quelle biatomiche, con la differenza che ci si serve di un maggior numero di orbitali atomici e tali orbitali molecolari si estendono all intera molecola.

21 Spettroscopia ottica Lo schema dei livelli energetici di una molecola può essere studiato mediante spettroscopia ottica, quindi facendo interagire le cariche presenti nelle molecole con radiazione elettromagnetica (r.e.m.). Esistono fondamentalmente tre tipi di spettroscopia ottica: Spettroscopia di assorbimento Attenuazione di r.e.m. Spettroscopia di luminescenza Emissione di r.e.m. Spettroscopia di diffusione Diffusione di r.e.m.

22 Spettroscopia di assorbimento Studia l attenuazione della r.e.m. dovuta all assorbimento da parte del sistema molecolare in funzione della lunghezza d onda. Sorgente hn 1 hn 2 E 2 E 1 Detector S 0 (n) E 0 n 1 =(E 1 -E 0 )/h=c/l 1 n 2 =(E 2 -E 0 )/h=c/l 2 S T (n) Gli spettrometri forniscono la misura spettrale della trasmittanza normalizzata, depurata degli effetti di riflessione sulle facce del campione: T( n ) S S T ( n ) ( ) 0 n

23 Spettroscopia di assorbimento Lo spettro di trasmissione non presenta righe di larghezza infinitesima ma bande di larghezza finita. I principali fattori che contribuiscono all allargamento dei riga sono: Tempo di vita dello stato eccitato t (allargamento intrinseco) Doppler Interazioni con l ambiente circostante (urti) Strutturazione in più bande sovrapposte ( esempio struttura vibrazionale) Spettro di trasmissione di Diclorometano in fase liquida

24 Spettroscopia di assorbimento Regola di selezione La transizione tra livelli energetici può essere indotta da r.em. solo se il passaggio da uno stato all altro dà luogo ad una variazione del momento di dipolo della molecola. In MQ l operatore momento di dipolo deve avere elemento di matrice non nullo tra gli stati di partenza e di arrivo. s* o s u P TRANS part part m arr e r arr s o s g Antisimmetrico (ungerate) Gli stati di partenza ed arrivo devo avere parità opposta.

25 Spettroscopia di assorbimento Regola di selezione La transizione tra livelli energetici può essere indotta da r.em. solo se il passaggio da uno stato all altro non dà luogo ad una variazione del momento di spin globale della molecola (in approssimazione di debole accoppiamento spin-orbita) Gli stati si distinguono in stati di singoletto (S TOT =0) e stati di tripletto (S TOT =1) hn hn Singoletto S TOT =0 Singoletto S TOT =0 Singoletto S TOT =0 Tripletto S TOT =1

26 Spettroscopia di assorbimento Macroscopicamente l assorbimento di un materiale è descritto dalla legge di Lambert-Beer. Essa si ricava assumendo che l intensità luminosa I, attraversando uno strato infinitesimo di spessore dx, diminuisca di una quantità di proporzionale allo spessore dx e all intensità stessi. Il coefficiente di proporzionalità a viene detto coefficiente di assorbimento. x di( x, n ) a ( n ) I( x, n ) dx dx di( x, n ) I( x, n ) a ( n ) dx I( x, n ) I 0 ( n ) e a ( n ) x I ( x) I 0 di a ( n ) I( x, n ) 0 x dx'

27 Spettroscopia di assorbimento I (x) [ W/m 2 ] a = 10cm -1 a = 5cm -1 a = 2cm -1 a = 1cm -1 a = 0.5cm -1 a = 0.2cm -1 a = 0.1cm I( x, n ) I x [ cm ] 0 ( n ) e a ( n ) x L intensità decresce esponenzialmente all interno del materiale assorbente a è il coefficiente di assorbimento ed è misurato in cm -1 L=1/a è la lunghezza di assorbimento e corrisponde al cammino necessario perché l intensità scenda di un fattore 1/e.

28 Spettroscopia di assorbimento Si definisce assorbanza la quantità: Nel caso di soluzioni di molecole organiche assorbenti in un solvente si usa definire la trasmittanza di un campione di spessore h come: Dove e(n) è il coefficiente di estinzione molare (L mol -1 cm -1 ) e C è la concentrazione (mol L -1 ). Si ha quindi che: A Ovvero A è proporzionale alla concentrazione. A T( n ) 1 log 10 T 10 e ( n ) Ch 1 log10 log10 n T e ( n ) Ch 10 e( ) Ch NOTA a( n ) ln10 e( n ) C 2.3 e ( n )C

29 Spettroscopia di assorbimento Nel visibile l assorbimento dei tessuti soffici è dato principalmente dall emoglobina in soluzione acquosa presente nel sangue. In un adulto l emoglobina (Hb) è presente normalmente in una concentrazione: C = g/l Considerato il peso molecolare dell Hb MW= dalton e che e Hb = L mol -1 cm -1 abbiamo: C = 2.2 mm = 2.2 mmol/l Perciò, ad esempio a l = 420nm, si ha: a = 2.3eC= cm -1 L = 1/a 4mm = m

30 Spettroscopia di assorbimento Richiamo alla Statistica di Boltzmann In condizioni di equilibrio termico la probabilità di occupare i livelli energetici di una molecola dipende dalla temperatura ( T ) e dalla separazione in energia dei livelli ( DE ). E DE ( k 23 e B 0 P E) P( E ) B T con k J / Il numero di molecole eccitato ad un livello di energia E è dato da: N( E) N( E ) 0 g( E) g( E ) DE k T dove g è il grado di degenerazione del livello di energia E. 0 e B K P(E) Livelli DE (ev) P(E 1 )/P(E 0 300K Elettronici Vibrazionali Rotazionali A T ambiente tutte le molecole sono nello stato elettronico e vibrazionale fondamentale. Gli stati rotazionali eccitati sono popolati.

31 Struttura degli spettri di assorbimento Se si analizza la forma delle singole bande si nota una sottostruttura che dipende dalla struttura vibrazionale dello schema dei livelli energetici molecolari. Tali bande vengono dette vibroniche. v =3 v =2 v =1 v =0 S 1 (LUMO) v=3 v=2 v=1 v=0 S 0 (HOMO) L ultimo livello elettronico occupato ed il primo libero vengono generalmente indicati rispettivamente Highest occupied molecular orbital (HOMO) e Lowest Unoccupied Molecular Orbital (LUMO)

32 Struttura degli spettri di assorbimento Molecola biatomica Si ha un solo modo di vibrazione lungo l asse della molecola Il potenziale di Morse è approssimato con quello di oscillatore armonico (parabola). I livelli vibrazionali sono equispaziati. Gli elettroni si muovono molto più velocemente dei nuclei (Approssimazione Born-Oppenheimer) Le transizioni elettroniche avvengono senza variazioni della distanza internucleare (Principio di Franck e Condon) A temperatura ambiente solo lo stato vibrazionale più basso del livello elettronico S 0 è occupato L intensità relativa delle bande vibroniche dipende dalla sovrapposizione delle funzioni d onda vibrazionali nei due stati elettronici S 0 e S 1.

33 Struttura degli spettri di assorbimento L intensità delle righe di assorbimento (ed emissione) è proporzionale all integrale di sovrapposizione delle funzioni d onda vibrazionali corrispondenti ai singoli livelli degli stati HOMO e LUMO. Le transizioni elettroniche tra gli stati vibrazionali più bassi dei due stati elettronici hanno la stessa energia (frequenza) sia in assorbimento che in emissione (zero-phonon line)

34 Struttura degli spettri di assorbimento A Molecole poliatomiche si hanno più modi di vibrazione possono contribuire contemporaneamente alla forma dello spettro di assorbimento. Lo spettro appare come un unica banda asimmetrica con componenti vibrazionali che sono difficilmente distinguibili hn ( ev ) Un analisi dettagliata dei modi di vibrazione è perciò molto difficile.

35 Spettri di assorbimento di cromofori endogeni I componenti biochimici di base sono caratterizzati da particolari legami o gruppi molecolari con particolari proprietà spettroscopiche: Gruppo carbonile Gruppo peptidico Doppi legami coniugati in polimeri lineari (caroteni, retinolo) e ciclici (derivati porfirinici, amminoacidi aromatici, basi degli acidi nucleici) Ioni di metalli di transizione in metallo-proteine: Mn, Fe, Co, Cu, Mo, V

36 Spettri di assorbimento di cromofori endogeni Intensità corpo nero a 5777K ( W/m 2 ) Fluenza corpo nero a 5777K ( fotoni/m 2 s ) Esempi Clorofille Carotenoidi 3x x x nm 640nm 6.0x x x x x l ( mm )

37 Spettri di assorbimento di cromofori endogeni Esempi Amminoacidi Fenilalanina (Phe) Tirosina (Tyr) Triptofano (Trp)

38 Spettri di assorbimento di cromofori esogeni Esistono un gran numero di cromofori organici che vengono utilizzati per marcare i componenti biochimici di base. Essi hanno particolari proprietà di assorbimento e luminescenza. ESEMPIO Coloranti tradizionali

39 Spettri di assorbimento di cromofori esogeni ESEMPIO Cianine Basati sul gruppo indolo parzialmente saturo con due unità aromatiche. Connessione tramite un ponte alchenico di lunghezza variabile Spettri di assorbimento ed emissione simili a quelli dei cromofori tradizionali Solubilità in acqua accresciuta Meno sensibili a ph ed ambiente organico Alta fotostabilità Alta resa quantica

40 Spettri di assorbimento di cromofori esogeni ESEMPIO Alexa Fluor Derivati dal colorante organico più diffuso, la Rodamina Maggiore resa quantica Ottima solubilità in acqua Insensibili a variazioni di ph Elevatissima fotostabilità