Epithelial-Mesenchymal Transition in Cancer. Relevance of Periostin Splice Variants

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1 DISS. ETH NO Epithelial-Mesenchymal Transition in Cancer Relevance of Periostin Splice Variants A dissertation submitted to the ETH Zurich For the degree of Doctor of Sciences Presented by Laura Morra Dipl.-Biol., Università degli Studi di Napoli Federico II, Italy Born 7 th of August, 1981 Citizen of Italy Accepted on the recommendation of Prof. Dr. Dario Neri (examiner) Prof. Dr. Holger Moch (co-examiner) Prof. Dr. Michael Detmar (co-examiner) 2011

2 1 Summaries 1.1 Summary Our study represents a comprehensive analysis of the epithelial-mesenchymal transition (EMT) marker periostin and its splice isoforms in renal cell carcinoma (RCC) and in non-small cell lung cancer (NSCLC). EMT can occur in both RCC and NSCLC, but the molecular mechanisms involved in this complex process are poorly understood. The matrix N-glycoprotein periostin can promote EMT of carcinoma cells and enhance tumor invasion. It shares homology with the insect cell adhesion molecule fasciclin 1 and acts as a ligand for the integrins, promoting the activation of the Akt/PKB and the FAK-mediated signaling pathways. Periostin-activated signaling pathways lead to cellular survival, resistance to hypoxia-induced cell death, angiogenesis and EMT. Periostin is expressed in normal tissues such as placenta, cardiac valves and periosteum, and it is upregulated in several types of cancer such as lung and kidney cancer. There are several isoforms generated by alternative splicing in the C-terminal region of periostin which are thought to modulate the periostin function in the extracellular matrix (ECM). The aim of this thesis was to study the periostin expression and to analyze the periostin isoform pattern in both RCC and NSCLC. For these purposes, we investigated the expression levels of periostin RNA and protein and the expression pattern of its spliced transcripts. We found that periostin was upregulated in RCC as well as in NSCLC at both mrna and protein levels. For both tumor types, the periostin protein was expressed in epithelial tumor cells as well as in the ECM and in the mesenchymal cells of the tumor stroma. In RCC, periostin mrna levels were higher in the clear cell than in the papillary subtype (p<0.01). In the clear cell subtype, periostin protein expression in epithelial tumor cells correlated with presence of sarcomatoid differentiation (p<0.001), higher tumor stage (p<0.001), lymph node metastases (p<0.05) and poor overall survival (p=0.009). In NSCLC, periostin mrna levels correlated with the adenocarcinoma histotype (p<0.05). In epithelial tumor cells, the immunohistochemically detected periostin protein correlated with tumor grade and size (p<0.05), and with tumor histotype (p<0.001). The periostin isoform 15

3 pattern was characterized at RNA level and, among the several periostin isoforms detected in fetal, cancerous and healthy adult tissues of the kidney and of the lung, five transcripts were newly identified in this study. On the basis of these data, we can conclude that the periostin protein expression in both tumor types may contribute to the EMT and play a role in metastasis. Additionally, the presence of a renal tumor-associated periostin isoform suggests splice-specific regulation in tumor tissue. 16

4 1.2 Riassunto Il presente studio rappresenta un analisi completa del marker di transizione epiteliomesenchimale (EMT) periostina e delle sue isoforme nel carcinoma renale (RCC) e nel tumore polmonare non a piccole cellule (NSCLC). L EMT può verificarsi in entrambi RCC e NSCLC, ma i meccanismi molecolari coinvolti in questo complesso processo sono ancora scarsamente compresi. La proteina di matrice N-glicosilata periostina può promuovere l EMT delle cellule tumorali e supportare il fenomeno di invasione tumorale. Essa condivide omologia con la proteina di guida assonica FAS1 e agisce da ligando per le integrine, promovendo l attivazione dei pathways cellulari mediati da Akt/PKB e FAK. I meccanismi di trasduzione del segnale attivati dalla periostina promuovono sopravvivenza cellulare, resistenza alla morte cellulare indotta da ipossia, angiogenesi ed EMT. La periostina è espressa in tessuti normali come la placenta, le valvole cardiache, il periosteo ed è up-regolata in molti tipi di cancro come quello del rene e del polmone. Esistono numerose isoforme generate da splicing alternativo nella regione C-terminale della periostina, le quali probabilmente ne modulano la funzione nella matrice extracellulare. Gli obiettivi di questo studio sono stati la caratterizzazione dell espressione della periostina e l analisi del pattern di espressione delle isoforme della periostina in entrambi i carcinomi renale e polmonare. Per questi scopi sono stati analizzati i livelli di espressione di RNA e proteina della periostina e il pattern di espressione dei suoi trascritti generati da splicing alternativo. La periostina è risultata essere up-regolata in RCC e in NSCLC sia a livello proteico che di mrna. Per entrambi i tipi di tumore, la proteina periostina era espressa nelle cellule tumorali epiteliali, nella matrice extracellulare e nelle cellule stromatiche. In RCC i livelli di RNA della periostina erano più alti nel carcinoma renale a cellule chiare che in quello papillare (p<0.01). Nel sottotipo a cellule chiare l espressione proteica della periostina nelle cellule epiteliali tumorali correlava con la presenza della differenziazione sarcomatoide (p<0.001), con uno stadio tumorale più avanzato (p<0.001), con la metastasi linfonodale (p<0.05) e con una minore sopravvivenza globale (p<0.009). 17

5 Nel NSCLC i livelli di mrna della periostina correlavano con il sottotipo istologico adenocarcinoma (p<0.05). La periostina rilevata immunoistochimicamente nelle cellule epiteliali tumorali correlava con il grado di differenziazione tumorale, con le dimensioni del tumore (entrambi p<0.05) e con il sottotipo istologico (p<0.001). Il pattern di espressione delle isoforme della periostina è stato caratterizzato a livello di RNA e tra le numerose isoforme rilevate nel tessuto fetale, cancerogeno e adulto sano del rene e del polmone, cinque sono state identificate per la prima volta in questo studio. Sulla base di questi dati, possiamo concludere che l espressione della proteina periostina potrebbe contribuire in entrambi i tipi di tumore all EMT e potrebbe avere un influenza sul processo metastatico. Inoltre, la presenza di un isoforma renale associata alla presenza di tumore suggerisce regolazione specifica attraverso splicing alternativo nel tessuto tumorale. 18