Eredita X-linked e inattivazione del cromosoma X

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1 Eredita X-linked e inattivazione del cromosoma X Lezione 10 1

2 Inattivazione del cromosoma X Nel 1966 Mary Lyon formulo l ipotesi che oggi porta il suo nome (lyonizzazione), per spiegare alcuni fenomeni osservati nelle cellule di mammifero di sesso femminile Si erano accumulate alcune osservazioni: Nei nuclei delle femmine e presente una masserella condensata che corrisponde al numero delle X meno 1 Lo stesso fenomeno si osserva nei maschi XXY, ma non nelle femmine X0 Marcando con timidina triziata nella tarda fase S si osserva la presenza di un cromosoma fortemente marcato che per dimensioni ed aspetto corrisponde al cromosoma X solo nelle cellule con almeno 2 cromosomi X. 2

3 X inattivo 3

4 Inattivazione del cromosoma X Altre osservazioni ottenute da Mary Lyon nei sui esperimenti sui topi: Femmine eterozigoti per 2 loci che determinano il colore del pelo e che mappano sul cromosoma X presentano mantello a chiazze (anche il gatto ha questo tipo di fenotipo) e non un colore uniforme anche se intermedio rispetto ai due colori. Il fenotipo e diverso se si osserva una eterozigote in cis o in trans: in cis: le macchie sono composte dei due colori in trans: le macchie sono o di un colore o dell altro. 4

5 Esperimenti di Mary Lyon nei topi I locus colore A: alleli A1 e A2 colore della punta: grigio (wt) o nero locus colore B: alleli B1 e B2 colore della base: marrone(wt) o giallo punte nere su marrone A2/y X A1/A1 punte grigie su marrone A1/y A1/A2 alla base: tutti marroni. alla punta: maschi grigi e femmine grigie e nere in regioni distinte 5

6 Esperimenti di Mary Lyon nei topi II locus colore A: alleli A1 e A2 colore della punta: grigio (wt) o nero locus colore B: alleli B1 e B2 colore della base: marrone(wt) o giallo punte grigie su giallo B2/y B1/B1 punte grigie su marrone X B1/y B1/B2 alla base: maschi marroni, femmine gialle e marroni in regioni distinte. alla punta: tutti grigi 6

7 Esperimenti di Mary Lyon nei topi III locus colore A: alleli A1 e A2 colore della punta: grigio (wt) e nero locus colore B: alleli B1 e B2 colore della base: marrone(wt) e giallo IL FENOTIPO A MACCHIE SI PRESENTAVA CON ENTRAMBI I LOCUS CHE CHIARAMENTE ERANO X LINKED (Esperimenti sulla Drosophila Genetica I) FECE INCROCI PER DEFINIRE IL LINKAGE FRA I DUE LOCUS (Ricordate i reincroci sempre genetica I?) E EBBE DELLE SORPRESE: LE FEMMINE CHE AVEVANO UGUALE GENOTIPO, NON AVEVANO UGUALE FENOTIPO: IL FENOTIPO DIPENDEVA DALLA FASE IN CUI SI TROVAVANO RECIPROCAMENTE GLI ALLELI DEI DUE LOCUS. 7

8 Esperimenti di Mary Lyon nei topi IV locus colore A: alleli A1 e A2 colore della punta: grigio (wt) e nero locus colore B: alleli B1 e B2 colore della base: marrone(wt) e giallo punte grigie su giallo A1/Y B2/y X A1/A2 B1/B1 punte grigie o nere su marrone A1/Y B1/Y A2/Y B1/Y A1/A1 B1/B2 A2/A1 B1/B2 maschi tutti marroni alla base alle punte 1/2 grigi, 1/2 neri questo mi conferma la fase della femmina parentale 1/2 femmine: punte grigie su macchie gialle o marroni 1/2 femmine: punte grigie sul giallo, punte nere sul marrone 8

9 Esperimenti di Mary Lyon V locus colore A: alleli A1 e A2 colore della punta: grigio (wt) e nero locus colore B: alleli B1 e B2 colore della base: marrone(wt) e giallo punte nere su giallo A2/Y B2/Y X A1/A1 B1/B1 punte grigie su marrone A1/A2 B1/B2 maschi tutti marroni con punte grigie femmine: punte grigie sul marrone, punte nere sul giallo 9

10 Esperimenti di Mary Lyon VI locus colore A: alleli A1 e A2 colore della punta: grigio (wt) e nero locus colore B: alleli B1 e B2 colore della base: marrone(wt) e giallo A2/A1 B1/B2 A1/A2 B1/B2 femmine: punte grigie sul giallo, punte nere sul marrone femmine: punte grigie sul marrone, punte nere sul giallo Queste femmine sono doppie eterozigoti, geneticamente sono uquali, ma hanno fenotipi differenti. Hanno anche fasi diverse: gli alleli dei due locus sono abbinati in modo diverso e questo che genera il fenotipo diverso. 10

11 Mary Lyon Ipotesi di Mary Lyon: Uno dei due cromosomi X presenti nella linea somatica femminile, viene precocemente inattivato durante lo sviluppo embrionale. L inattivazione e casuale. Come risultato la femmina e un mosaico di cellule funzionalmente emizigoti per uno o l altro dei cromosomi X. 11

12 G6PD-HPRT Donna eterozigote G6PD+/- Donna eterozigote HPRT+/- 12

13 G6PD Cellule di donna eterozigote G6PD+/- Coltura originaria Coltura di singolo clone Coltura di singolo clone Direzione migrazione Lenta Veloce 13

14 Inattivazione del cromosoma X L inattivazione del cromosoma X avviene intorno al 15mo-16mo giorno dell embriogenesi (l embrione e composto di circa 5000 cellule). Una volta che un cromosoma X (materno o paterno) e stato inattivato lo sara in tutte le popolazioni cellulari che derivano da quella cellula. La casualita dell inattivazione e tipica dei mammiferi: nei marsupiali viene inattivato preferenzialmente il cromosoma paterno. Nel topo le cellule del trofoblasto inattivano il cromosoma X paterno per una ragione tuttora ignota. La casualita viene meno in presenza di X riarrangiate 14

15 Zigote 15mo-16mo giorno Xmat Xpat Inattivazione casuale Inattivazione del cromosoma X schema Come avviene l inattivazione e come viene mantenuta? 15

16 L inattivazione domande Vengono inattivati tutti i geni della X? No, inizialmente si riteneva che l inattivazione coinvolgesse tutto il cromosoma, oggi sappiamo che non vengono inattivati i geni della regione pseudoautosomica : i geni di questa regione hanno un omologo sul cromosoma Y Non vengono inattivati geni che hanno pseudogeni sul cromosoma Y, e altri geni per i quali non si conosce la ragione. Comunque il cromosoma X risulta inattivato al 90% C e una regione sul cromosoma X da cui inizia l inattivazione? Come avviene e come si mantiene l inattivazione? 16

17 L inattivazione domande C e una regione sul cromosoma X da cui inizia l inattivazione? Si, la regione Xq13. In questa regione e presente il centro di inattivazione Xic che agisce in cis. E stato individuato un locus Xist che sembra essere il gene che controlla il processo di inattivazione. La mappatura di Xic e il clonaggio di Xist sono stati resi possibili grazie allo studio dei riarrangiamenti del cromosoma X in cui l inattivazione non casuale: l inattivazione dipende dal tipo di riarrangiamento 17

18 L inattivazione le traslocazioni X/Autosoma Xic agisce in cis: il frammento fisicamente separato non puo inattivarsi due copie Xp attive parte autosoma inattiva morte della cellula Inattivazione X X/A A/X A casuale dell X un cromosoma X attivo due autosomi attivi questo clone e l unico che si ritrova 18

19 L inattivazione X(isop), X(isoq) e X(del) X Isocromosoma del braccio corto non si ritrova mai Isocromosoma del braccio lungo sempre inattivato (Sindrome di Turner) delezione del braccio corto sempre inattivato (Sindrome di Turner) delezione del braccio lungo sempre inattivato se la delezione non coinvolge Xq13 (Sindrome di Turner) 19

20 L inattivazione Come avviene e si mantiene l inattivazione? Il clonaggio di Xist (X-inactive specific transcript) non ha chiarito completamente il meccanismo: il prodotto di questo gene (15Kb) non ha ORF, si ritiene che appartenga alla classe dei geni il cui prodotto funzionale non e una proteina, ma un mrna. Viene trascritto solo dal cromosoma inattivo, e espresso nel nucleo, promuove il processo di inattivazione rimodellando la cromatina attraverso l ipoacetilazione degli istoni e la metilazione dei geni. Dall inattivazione deriva l eterocromatizzazione (corpo di Barr e la replica tardiva del cromosoma X inattivato 20

21 L inattivazione Come avviene e si mantiene l inattivazione? Si ritiene che l inattivazione venga ottenuta metilando le isole CpG. I geni presenti sul cromosoma inattivato sono ipermetilati se confrontati con gli omologhi dell altro cromosoma o del cromosoma X del maschio. Ricordare che le isole CpG sono presenti al 5 dei geni e si ritiene che rappresentino il sito di inizio della trascrizione. Una volta che la metilazione e avvenuta al momento di duplicare il DNA la citosina metilata verra riconosciuta come tale dall enzima che metilera la citosina dell elica neosintetizzata, garantendo il mantenimento 21

22 L inattivazione e l eredita X-linked Ipotesi di Mary Lyon: Uno dei due cromosomi X presenti nella linea somatica femminile, viene precocemente inattivato durante lo sviluppo embrionale. L inattivazione e casuale. Come risultato la femmina e un mosaico di cellule funzionalmente emiziogoti per uno o l altro dei cromosomi X. La femmina portatrice di una patologia X-linked e protetta dalla presenza nel 50% delle sue cellule di un gene funzionante. L inattivazione non casuale di un cromosoma X per effetto di un riarrangiamento puo aiutare a clonare un gene malattia 22

23 L inattivazione del cromosoma X e i geni X-linked 23

24 X-linked recessiva Esprimono il carattere quasi esclusivamente i maschi? I genitori di solito non presentano il carattere soprattutto se e una patologia grave. Lo stato di portatrice della madre e certo se ha il padre fratelli o parenti maschi che manifestano (nel caso dele patologie gravi il padre non e mai affetto)????? Le femmine possono manifestare il carattere: 1. se il padre lo presenta e la madre eterozigote 2. se l inattivazione del cromosoma X non e casuale 24

25 Il gene della distrofina Perche il gene della distrofina? Perche e stato il gene il cui clonaggio ha rivelato la complessita del genoma e la presenza di giant gene, perche la mutazione del suo gene provoca una patologia letale relativemente frequente fra i maschi nati vivi (1:3500), perche ci permette di vedere altri approcci allo studio e al clonaggio dei geni, perche la diagnostica presenta alcune difficolta e ci permettera di illustrare alcuni test 25

26 Un po di storia DMD-RFLP Nel 1982 venne identificato il primo RFLP associato al locus DMD in Xp21. Nel giro di poco tempo altri RFLP permisero di eseguire il gene tracking. Non si trovarono pero polimorfismi con ricombinazione inferiore al 5%. Nel 1985 la mappa della regione era stata in parte ricostruita e la situazione che si presentava era: L1.28 OTC 754 C D2 10cM 2cM 8cM 7cM 8cM 5cM DMD 26

27 DMD- X/autosomi Nel frattempo si erano raccolti i DNA di circa 20 ragazze affette da DMD che presentavano traslocazioni X/autosomi. Tutte presentavano il breakpoint sulla X in Xp21 ed erano casi sporadici. L ipotesi era che il riarrangiamento avesse rotto il gene DMD e che per effetto dell inattivazione preferenziale del cromosoma X normale, venisse manifestato il fenotipo Duchenne 27

28 DMD Inattivazione due copie Xp attive parte autosoma inativa gene DMD attivo DMD morte della cellula Inattivazione X X/A A/X A casuale dell X un cromosoma X attivo due autosomi attivi gene DMD non funzionante Affetta da DMD 28

29 DMD-XJ 1985 A Toronto un gruppo di ricercatori utilizzando il Dna di una donna DMD portatrice di una traslocazione X/21, riusci a clonare il breakpoint, e individuo una serie di cloni (XJ)che, oltre ad essere polimorfici, evidenziavano delezioni in alcuni pazienti DMD. rdna rdna DMD? 29

30 DMD- Clonaggio 1986 A Boston il gruppo di Kunkel utilizzando il DNA di un paziente, BB, portatore di un delezione citogenetica ed affettoda DMD, retinite pigmentosa, ritardo mentale e malattia granulomatosa cronica riesce a clonare il gene DMD. La loro strategia si baso sul clonaggio per sottrazione: il paziente era deleto per una grossa regione genomica, il suo DNA fatto riassociare con DNAnormale avrebbe lasciato in soluzione le sequenze normali non presenti nel DNAdeleto. Con quei cloni fu testata una libreria di cdna di muscolo e vennero clonaticirca 8 cdna che, testati sui pazienti, misero in evidenza delezioni. Lo zoo-blot confermo trattarsi di un gene conservato, la sequenza evidenzio nei pazienti mutazioni puntiformi di varia natura. 30

31 DMD-Distrofina Quale e il prodotto del gene DMD? L RNA e lungo 13kb, la proteina ha un peso molecolare superiore a 400kDa, e espresso dal muscolo, anche se costituisce solo lo 0.002% delle proteine totali.l estremita N-terminale costituisce il dominio legante l actina, segue un ampio dominio a bastoncello, con 24 ripetizioni di sequenze simili composte da 109 amminoacidi. Dopo questo dominio e presente un dominio ricco in cisteina leganteil Calcio, infine l estremita C-terminale (420AA) interagisce con le altre proteine. N-terminale ripetizioni ad α elica dominio legante Ca C-terminale 31

32 DMD-Distrofina Quale e e la funzione del gene della distrofina? Fa parte di un complesso che attraversando la membrana collega i filamenti di actina del citoscheletro con la matrice extracellulare (membrana basale) 32

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34 DMD-Becker La distrofia di Becker in che relazione e con DMD? Dall analisi di linkage era gia emerso che avrebbero potuto essere alleliche Dopo il clonaggio del gene DMD le stesse sonde sono state testate sui pazienti affetti da BMD: sono evidenti delezioni e mutazioni puntiformi. tutte le evidenze sperimentali confermano che il locus e lo stesso. 34

35 DMD-Becker La distrofia di Becker in che relazione e con DMD? Non e stato possibile individuare una regione critica specifica per le due forme. Lo studio a livello di proteina ha evidenziato che in BMD la distrofina e sempre presente anche se piu corta o in minore quantita 35

36 Ricerca delle mutazione nel gene DMD Due terzi dei casi di Distrofia Muscolare di Duchenne sono dovuti a delezioni che coinvolgono uno o piu esoni Ci sono due hot spot di mutazioni: 5 esoni dal 3 all 8 e al 3 esoni dal 44 al 60 (principalmente 44-50) Si usa una PCR multiplex con reazioni prodotte da piu coppie di primer, ognuna delle quali amplifica uno specifico esone. Se c e la delezione non c e amplificazione (naturalmente si sa quale e l aspetto di una corsa elettroforetica di un maschio normale.) L interpretazione nel caso delle femmine eterozigoti puo essere ambigua perche la X normale viene amplificata 36

37 Multiplex per le delezioni DMD Test per evidenziare gli esoni 42, 43, 44, 45, 47, 48, 50, 51, 52, Miscela A Miscela B 51 A M C B A 1B 2A 2B A 3B 4A 4B 5A 5B 6A 6B DNA AFFETTI fig

38 Il materiale didattico e presente in rete: NON sono dispense, ma un ausilio allo studio sul libro 38