REPLICAZIONE DEL DNA 1

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Marina Sartori
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1 REPLICAZIONE DEL DNA 1

2 La replicazione del DNA è semiconservativa: ciascuno dei due filamenti parentali serve da stampo per la sintesi di un nuovo filamento e le due nuove doppie eliche sono costituite ognuna da un filamento vecchio e da un filamento nuovo. 2

3 Complesso multi-proteico per le replicazione del DNA DNA elicasi DNA primasi Proteina SSB (Single Strand-Binding Protein) DNA polimerasi DNA topoisomerasi DNA ligasi 3

4 4

5 5

6 Tutte le DNA polimerasi in tutti gli organismi sono capaci di sintetizzare DNA soltanto in direzione - Direzione di sintesi DNA polimerasi DNA dipendente 6

7 nucleotide (nucleoside trifosfato): elemento costitutivo (monomero) degli acidi nucleici 7

8 La DNA polimerasi allunga il filamento nascente aggiungendo un nucleoside trifosfato (nucleotide) all estremità OH 8

9 Entrambi i filamenti servono da stampo per la sintesi di nuovi filamenti, quindi la sintesi procede sui due filamenti stampo in direzione opposta Direzione di sintesi 9

generando due filamenti singoli Le ssbp (single strand binding proteins) legano il

10 Replicazione del DNA 1 In corrispondenza delle origini di replicazione l elicasi svolge i filamenti parentali della doppia elica rompendo i legami H tra le basi e generando due filamenti singoli Le ssbp (single strand binding proteins) legano il singolo filamento e lo stabilizzano Denaturazione del DNA helicase Origin of replication 10

Replicazione del DNA 2 La primasi (RNA polimerasi-dna dipendente) sintetizza un breve innesco (primer) a RNA (le DNA pol non sono in grado di iniziare

11 Replicazione del DNA 2 La primasi (RNA polimerasi-dna dipendente) sintetizza un breve innesco (primer) a RNA (le DNA pol non sono in grado di iniziare ex novo la sintesi, ma solo di allungare un preesistente) La DNA polimerasi III estende l innesco a RNA sintetizzando DNA innesco helicase helicase 11

12 La DNA polimerasi procede, sul filamento leading, nella stessa direzione di avanzamento della elicasi e quindi in maniera continua Ma cosa succede sul filamento complementare? Leading strand helicase 12

13 Il filamento ritardato (lagging strand) viene sintetizzato in maniera discontinua (la DNApol III va in direzione opposta rispetto all elicasi), attraverso la sintesi di una serie di frammenti (fr. di Okazaki) helicase primase 13

14 Replicazione del DNA 3 Rimozione del primer a RNA e gap filling da parte della DNA pol I che attacca nucleotidi al libero del frammento di Okazaki precedente mentre degrada il primer a RNA helicase 14

15 Azione della DNA pol I Primer RNA DNA pol I DNA pol I 15

16 Replicazione del DNA 4 Saldatura dei frammenti (ligasi) helicase ligase 16

17 Extension - The Replication Fork Laging Strand Okazaki fragment DNA Polymerase RNA Primers Primase Single strand binding proteins Helicase Leading Strand 18

La separazione dei filamenti di una struttura

Topoisomerasi I rompono transitoriamente una

quella integra e infine riuniscono le estremità

rilassare (eliminare) le tensioni che si creano

18 La separazione dei filamenti di una struttura elicoidale genera dei superavvolgimenti Topoisomerasi I rompono transitoriamente una sola delle catene del DNA, la ruotano attorno a quella integra e infine riuniscono le estremità interrotte Le Topoisomerasi hanno il compito di rilassare (eliminare) le tensioni che si creano nella doppia elica del DNA in seguito ai processi cellulari che implichino un cambiamento di topologia del DNA (trascrizione, replicazione del DNA) 19

19 Replicazione dell estremità del cromosoma DNA stampo primer fine cromosoma DNA in sintesi 20

20 Telomeri Le estremità dei nuovi filamenti di DNA, negli eucarioti, non possono essere replicate, dopo la rimozione dei primer perché non esiste un estremità per l aggiunta dei nucleotidi. Ad ogni ciclo replicativo le molecole di DNA si accorciano Presenza di sequenze ripetute i telomeri che non contengono geni. Nelle cellule germinali, che devono preservare i genomi immutati nel corso delle diverse generazioni, sono presenti le telomerasi che allungano i telomeri. Probabile correlazione tra invecchiamento e accorciamento dei telomeri. Trovata attività telomerasica in cellule tumorali. 21

21 Telomeri Sequenze ripetute all estremità dei cromosomi Costituiti da alcune migliaia di ripetizioni di sequenze brevi Nell uomo: (TTAGGG)n Proteggono il cromosoma dalla degradazione ad opera di nucleasi (sono ripiegati su se stessi) ed impediscono che le estremità dei cromosomi si saldino tra di loro 22

22 Telomeri Nelle cellule germinali e nelle cellule staminali la lunghezza dei telomeri rimane costante ad ogni divisione cellulare grazie all attività della telomerasi Nelle cellule somatiche differenziate ad ogni replicazione del DNA il telomero subisce un accorciamento La riduzione dei telomeri dopo n divisioni provoca arresto della crescita cellulare e apoptosi 23

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24 Caratteristiche delle DNA polimerasi Hanno attività polimerasica SOLO in direzione - Necessità di innesco a RNA (primer) Attività esonucleasica - correzione di bozze 25

25 Alla DNA polimerasi è associata un attività esonucleasica che consente la correzione di bozze = rimozione di nucleotidi errati. Con questo sistema vengono corretti gli errori di appaiamento commessi dalla DNA pol mentre la replicazione è in corso. tasso di errore durante la sintesi 1 su nt; dopo correzione 1su dieci miliardi nt. È sufficientemente basso? 26

26 Nel genoma umano (aploide) ci sono c.a. 3 x10 9 nt di questi solo il 2% sono sequenze codificanti (esoniche) Se non ci fosse correzione di bozze (tasso di errore durante la sintesi 1x10-4 nt): 6000 mutazioni cadrebbero in sequenze codificanti a ogni replicazione del DNA Dopo correzione di bozze ( 1x10-10 nt ): mutazioni cadono in sequenze codificanti a ogni replicazione del DNA (1 mutazione ogni 166 replicazioni) Sono comunque maggiori di quelle osservate in una cellula, perché intervengono dei processi di riparazione del DNA post-replicativi 27

27 RIPARAZIONE DEI DISAPPAIAMENTI (mismatch repair) Provvede ad effettuare una scansione del DNA dopo la replicazione alla ricerca di appaiamenti errati Il sistema di riparazione è in grado di riconoscere e riparare il filamento di nuova sintesi 28

28 tasso di errore durante la sintesi 1x10-4 nt dopo correzione 1x10-10 nt è sufficientemente basso? Difetti nel mismatch repair Mutazioni nei geni che codificano per gli enzimi coinvolti nel mismatch repair sono associate al cancro. La cellula non riesce a riparare le mutazioni che si accumulano in tutto il genoma e che, quando colpiscono geni che regolano la proliferazione cellulare, inducono la trasformazione cancerosa (es: cancro del colon non poliposico ereditario HNPCC, autosomica dominante) 29

29 30

30 I processi di riparazione del DNA post replicativi sono ESSENZIALI 31

31 Un errore non corretto viene poi perpetuato nei cicli di replicazione successivi 32

32 Le lunghe molecole di DNA lineare dei cromosomi eucarioti hanno origini di replicazioni multiple Direzione di replicazione bidirezionale a partire da ORI multiple 33

33 Replicazione del DNA circolare ORI è sequenza ricca in A-T Nei procarioti l origine di replicazione è singola Direzione di replicazione bidirezionale a partire da ORI 34

35 La replicazione a circolo rotante Comune in alcuni virus e nel fattore F di E.coli

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