Università degli Studi di Urbino

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1 Università degli Studi di Urbino Facoltà di Scienze e Tecnologie Effetto della temperatura nella preparazione e nell'uso di nano-colonne HPLC di Fabiana Capriotti Relatore: Achille Cappiello A. A

2 INTRODUZIONE Lo scopo di questa tesi di laurea è di investigare l effetto della temperatura nella procedura di impaccamento e nelle prestazioni di nano-colonne HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Queste colonne accoppiate alla spettrometria di massa consentono di caratterizzare composti presenti in tracce in miscele complesse e trovano un crescente impiego in diversi campi di applicazione incluso quello ambientale. Abbiamo preparato delle sospensioni di fase stazionaria (slurry), in un opportuna miscela di solventi, a diverse temperature e ne abbiamo verificato la stabilità nel tempo. Abbiamo quindi messo a punto una procedura di impaccamento con cui abbiamo riempito le colonne. Queste sono state valutate a diverse temperature tenendo conto dei parametri cromatografici fondamentali, quali il fattore di capacità, k, il fattore di asimmetria, As, il numero di piatti teorici, N e la curva di Van Deemter. Utilizzando una miscela test di analiti, è stato possibile osservare come la temperatura influenzasse la separazione cromatografica. Sono state poi eseguite alcune analisi su un campione reale, nelle condizioni di temperatura ottimali, interfacciando la colonna con uno spettrometro di massa dotato di interfaccia a ionizzazione elettronica. 1

3 PARTE I 2

4 Capitolo I Le nano-colonne HPLC Per nano-colonne HPLC si intende quelle che hanno un diametro interno (i.d.) compreso tra 10 e 150 µm. Questo tipo di colonne utilizza un flusso di fase mobile dell ordine dei nanolitri (nl)/min. Questo comporta un aumento della concentrazione del soluto e della solubilità quando si impiegano rivelatori sensibili alla concentrazione. Sono particolarmente adatte quando si devono analizzare quantità minime di campione, inoltre i flussi bassi ai quali si opera facilitano l accoppiamento di questa tecnica cromatografica con rivelatori come lo spettrometro di massa [9]. Così oggi è possibile distinguere le tecniche HPLC in base al diametro della colonna come riportato nella seguente tabella: Rapporto tra l i.d. della colonna, il flusso e il guadagno di sensibilità Tecnica HPLC Diametro interno della colonna Flusso Guadagno relativo della sensibilità Conventional LC 4.6 mm 1.0 ml/min 1 Narrowbore LC 2.1 mm 200 µl/min 5 Microbore LC 1.0 mm 50 µl/min 21 Capillary LC 300 µm 4 µl/min 235 Nano LC 75 µm 250 nl/min 3800 A grandi linee la scelta del tipo di colonna da utilizzare dipende principalmente da tre fattori: la quantità disponibile di campione, la complessità del campione e il tipo di rivelatore. 1.1 Vantaggi nell uso delle nano-colonne La riduzione del diametro interno delle colonne in HPLC, quindi la miniaturizzazione in nano- HPLC, può essere interessante per diverse ragioni tra le quali un aumento della sensibilità, una adattabilità maggiore all accoppiamento con gli spettrometri di massa e un minor consumo di solvente. Tra queste la prima è sicuramente la più importante specialmente se si lavora con minime quantità di campione: si ha infatti un miglioramento dei picchi grazie alla riduzione della diluizione del campione. Dal momento che la diluizione del campione è direttamente proporzionale al volume della colonna, un semplice approccio per migliorare la sensibilità della rilevazione, dipendente dalla concentrazione del campione, è proprio quello di diminuire il diametro della colonna. In questo modo è possibile incrementare il rapporto segnale-fondo (S/N) dei picchi cromatografici. Considerando che la concentrazione del campione alla fine della colonna è inversamente proporzionale al quadrato del diametro della colonna, l incremento della sensibilità che 3

5 teoricamente può essere raggiunto utilizzando una nano-colonna al posto di una colonna convenzionale può essere calcolato attraverso il fattore di scala f : f = (i.d.standard) 2 /(i.d.nano) 2 Quindi utilizzando una nano-colonna (i.d. 75 µm) con le stesse caratteristiche di quella convenzionale ad eccezione del raggio, e assumendo che venga iniettata la stessa quantità di campione senza dispersione, l incremento teorico della sensibilità della rilevazione rispetto ad una colonna convenzionale è di circa 3800 (f = /75 2 ). Inoltre, diminuendo il diametro della colonna, si può ottenere un abbassamento dell altezza equivalente del piatto teorico con un incremento dell efficienza cromatografica. Di seguito è riportata la variazione del rapporto S/N in funzione del diametro della colonna: i.d. 4,6mm i.d.75 µm S/N=1 Flusso 1mL/min S/N=3800 Flusso 200nL/min Occorre tener conto che il volume di iniezione, ovvero la quantità di campione che è possibile introdurre in testa alla colonna, è molto più basso nelle nano-colonne rispetto a quelle a diametro maggiore. L effetto che un volume di iniezione inferiore provoca sul rapporto S/N è esattamente l opposto di quello dovuto alla riduzione del raggio della colonna, cioè contribuisce negativamente sulla sensibilità. Tuttavia la riduzione del diametro ha un influenza decisamente predominante con il risultato che comunque l uso di una nano-colonna comporta un effetto sul limite di rivelabilità complessivamente positivo. Nella tabella seguente sono riportati i volumi di iniezione per alcuni valori del diametro interno delle colonne: Diametro interno (µm) Flusso (nl/min) Volume di iniezione (nl) < < < <10 Un altro vantaggio nell utilizzare colonne con diametro inferiore è la maggiore compatibilità del basso flusso con sistemi di rivelazione come lo spettrometro di massa. Alcune delle tecniche di interfacciamento e ionizzazione LC-MS come l ESI (Electrospray ionization) o l APCI (Atmospheric pressure chemical ionization), sono sensibili alla concentrazione e non alla quantità assoluta della sostanza iniettata. Pertanto, un flusso ridotto di fase mobile induce un aumento di concentrazione e, quindi, di sensibilità strumentale. Flussi più bassi, ad esempio, portano ad una più piccola dimensione delle goccioline nella ionizzazione elettrospray. Goccioline di dimensioni minori evaporano più facilmente, quindi si ha un miglioramento dell efficienza della ionizzazione e conseguentemente nella rilevazione. Un ulteriore vantaggio, sia ambientale che economico, è la riduzione del consumo di solvente per la fase mobile in strumenti che non hanno un sistema di split, cioè un sistema che permette di scaricare una parte del solvente che entrerà in colonna, questo ovviamente permette di abbassare i 4

6 costi ed ha quindi un importanza soprattutto economica. D altra parte, i limiti di rivelabilità sempre più bassi, ottenuti per alcune sostanze con rivelatori ad elevata sensibilità, richiedono una sempre maggiore purezza dei solventi che si traduce inevitabilmente in un aumento dei costi. Per mantenere la qualità delle prestazioni del sistema cromatografico e per lavorare in condizioni ottimali, in nano-hplc è necessario ridurre e adattare al flusso e al diametro interno della colonna ogni elemento del sistema. Di conseguenza, tutti i capillari di connessione, insieme ai volumi di iniezione e di rivelazione, devono essere ridotti e adattati alla nano-colonna. Ciò comporta una maggiore complessità di analisi e di difficoltà nell ottenere un alta performance del sistema, dovendo evitare l effetto negativo di un allargamento di banda al di fuori della colonna stessa. Infatti, l allargamento della banda, dovuto ai volumi morti che si trovano nel sistema, deve essere contenuto. Questo è possibile se i volumi morti del sistema sono modesti rispetto al volume di iniezione, di conseguenza occorre una miniaturizzazione del sistema cromatografico. 1.2 Caratteristiche delle nano-colonne Uno dei metodi più usati per l impaccamento delle nano-colonne utilizza la tecnica slurry-packing: con il termine slurry si indica una sospensione uniforme della fase stazionaria che verrà utilizzata come riempimento della colonna. Il liquido utilizzato dovrebbe essere tale da mantenere in sospensione la fase senza lasciarla sedimentare. I solventi usati per lo slurry devono essere puri e dare luogo a deboli interazioni di adsorbimento con la fase stazionaria poichè in caso contrario il solvente verrebbe difficilmente rilasciato[2]. Sia il capillare che il frit della colonna(un filtro che trattiene la fase stazionaria) sono solitamente realizzati in silice fusa, con un rivestimento protettivo che incrementa la robustezza meccanica della colonna. La levigatezza della superficie interna in silice fusa, l alta resistenza meccanica, la trasparenza alla luce fanno di questo materiale l ideale per la produzione di nano-colonne. L unico limite è dovuto alla stabilità del ph della silice fusa rispetto ad altri materiali quali acciaio inossidabile o PEEK[9]. Una volta impaccata la colonna è necessario controllarne le prestazioni. Per questo si usano miscele standard di soluti, che possono anche essere usate periodicamente per controllare il buon funzionamento della colonna. 5

7 Capitolo II Efficienza e risoluzione della colonna Il processo cromatografico ideale è quello in cui i componenti di una miscela si separano in bande strette, completamente risolte le une dalle altre. La dimensione di una banda o di un picco è una misura dell efficienza di un processo separativo, mentre la risoluzione è determinata dalla capacità del sistema di risolvere picchi di analiti che hanno tempi di ritenzione t R vicini [3]. 2.1 Efficienza L efficienza N nelle separazioni su colonna è correlata al volume di ritenzione e alla larghezza di banda in termini di deviazione standard, assumendo idealmente picchi di forma gaussiana, cioè N= (t R / s) 2. In pratica, risulta più semplice misurare la larghezza del picco cromatografico alla linea di base o a metà altezza,utilizzando una delle seguenti espressioni: N= 16 (t R / w b ) 2 o N= 5.54 (t R / w h/2 ) 2. In tali espressioni w b indica la larghezza del picco alla base e w h/2 è la larghezza del picco misurata a metà altezza. Il parametro N indica il numero dei piatti ed è legato al parametro H o HETP (altezza equivalente del piatto teorico) dalla relazione N = L (lunghezza della colonna)/ H. La larghezza globale del picco al termine della separazione è determinata dall entità dei fenomeni di diffusione, che si manifestano durante la migrazione del soluto attraverso il sistema separativo, dal diametro e dalla forma delle particelle, dalla velocità del trasferimento di massa tra le due fasi e dalla velocità della fase mobile. Figura 1 Influenza della diffusione molecolare longitudinale sull'allargamento della banda: a) le molecole della sostanza, che inizialmente formano una banda stretta in testa alla colonna, diffondono spontaneamente in senso longitudinale b) procedendo lungo la colonna la banda si allarga sempre di più 6