Diagnostica virologica arte e tecnica di formulare la diagnosi

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1 Diagnostica virologica arte e tecnica di formulare la diagnosi Una rapida diagnosi della malattia e del suo agente eziologico è alla base di un efficace trattamento e cura di una patologia in atto. Una rapida e precisa diagnosi di un infezione virale si fonda sull analisi dei dati clinici e degli esami di laboratorio.

2 METODI DIAGNOSTICI IN VIROLOGIA Determinazione DIRETTA: ricerca ed identificazione del virus o dei suoi componenti nel campione ottenuto dal paziente (sangue, liquor, biopsia, espettorato). Determinazione INDIRETTA: ricerca di anticorpi specifici (risposta immunitaria) contro antigeni virali nell organismo potenzialmente infetto.

3 Indagine virologica: ricerca nei materiali biologici del virione o componenti di esso (proteine o acidi nucleici) - Isolamento virale con crescita (secrezioni, biopsie, sangue) su colture cellulari e successiva tipizzazione (giorni) - Identificazione diretta (secrezioni, biopsie, sangue): ricerca di antigeni virali tramite saggi immunoenzimatici (EIA) o radiometrici (RIA); ricerca di acidi nucleici virali tramite Southern blot, Northern blot e reazione di polimerizzazione a catena (PCR); identificazione diretta del virus con tecniche di microscopia elettronica, immunofluorescenza (ore) Indagine sierologica: ricerca di anticorpi specifici diretti contro antigeni virali (su siero di pazienti) con tecniche: western blot, saggi immunoenzimatici (EIA o ELISA) o radiometrici (RIA), neutralizzazione, fissazione del complemento, inibizione dell emoagglutinazione (ore)

4 Indagine sierologica: Oggi si preferiscono usare saggi tipo EIA, ELISA e RIA, basati sulla reazione antigene-anticorpo. Possibilità di automazione, altamente sensibili, specifici, analisi quantitativa. Possibilità di misurare l aumento del titolo anticorpale durante l infezione (indice di infezione in atto). Ove possibile si valutano la presenza di IgM che indicano solitamente un infezione recente o in atto. Alternativa IgA, che offrono il vantaggio di non ricomparire nel siero durante le reinfezioni. Presenza di IgG, infezione pregressa, immunizzazione (vaccino, o guarigione), ma anche infezione in atto. Problema: difficoltà di individuare il sierotipo coinvolto nell infezione in famiglie di virus composite.

5 Indagine sierologica: Saggio di fissazione del complemento Il campione di siero viene fatto reagire con quantità nota di virus e complemento. L anticoprpo specifico, se presente, forma un complesso con il virus o l antigene virale e fissa il complemento. Successivamente alla miscela viene aggiunto un sistema di rilevazione di emazie ed anticorpi anti-emazie. Se l anticorpo è presente non ci sarà la lisi delle emazie, non rilascio di emoglobina, nessun segnale. Se l anticorpo è assente, il complemento libero fisserà l immunocomplesso di emazie-anticorpi antiemazie, causando la lisi delle emazie con rilascio di emoglobina, che verrà misurata allo spettrofotometro. Titolo di anticorpi fissanti il complemento: ultima diluizione alla quale si osserva inibizione della lisi delle emazie.

6 Indagine virologica: ricerca nei materiali biologici del virione o componenti di esso (proteine o acidi nucleici) - Isolamento virale con crescita (secrezioni, biopsie, sangue) su colture cellulari e successiva tipizzazione (giorni) - Identificazione diretta (secrezioni, biopsie, sangue): ricerca di antigeni virali tramite saggi immunoenzimatici (EIA) o radiometrici (RIA); ricerca di acidi nucleici virali tramite Southern blot, Northern blot e reazione di polimerizzazione a catena (PCR); identificazione diretta del virus con tecniche di microscopia elettronica, immunofluorescenza (ore)

7 La scelta del campione è in relazione alla sede dell infezione.

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9 Riconoscimento della moltiplicazione virale in colture cellulari Attraverso l effetto citopatico (evidenza diretta): comparsa di alterazioni cellulari (necrosi, apoptosi, citofagia, agglutinazione cellulare, formazione di sincizi). Osservabile al microscopio a piccolo ingrandimento. Molto frequente. Attraverso evidenza indiretta (non apprezzabile all osservazione microscopica delle cellule): saggiando la presenza di potere agglutinante nel liquido di coltura, la presenza di antigeni virali (mediante immunofluorescenza), emoadsorbimento, interferenza, ecc. L esame al microscopio elettronico permette sia la conta delle particelle virali sia la loro caratterizzazione morfologica.

10 Disruption of astrocytic monolayer induced by exposure to supernatants from HIV-infected macrophages AA BB C C Representative photomicrographs (optical microscopy 340x) of astrocyte cell monolayers: after 6 days of exposure to supernatants of mock-infected M/M (A), after 6 days (B), and after 10 days (C) of exposure to supernatants of HIV-infected M/M.

11 Cytopathic effect (CPE) resulting from virus infection. The center portion of the figure shows monkey (Vero) cells rounding up and detaching from the substrate after infection with Herpes simplex virus 1 (HSV-1). A normal monolayer of cells is visible around the focus of CPE. The cells were fixed with methanol and stained with Giemsa stain. Micrograph courtesy of M. Kosz-Vnenchak.

12 Coltivazione e titolazione dei Virus Essendo i virus parassiti intracellulari obbligati, per poterne ottenere la moltiplicazione in laboratorio è necessario disporre di cellule viventi (animali da laboratorio o colture cellulari) sensibili (deve far entrare il virus) e permissive (deve far replicare il virus)..

13 I primi isolamenti di virus furono fatti coltivandoli in topini neonati (mancanti ancora di difese immunitarie) o in embrioni di pollo. Nell embrione di pollo i virus vengono inoculati attraverso appositi fori praticati nel guscio, nei liquidi contenuti in una delle cavità (allantoidea o amniotica) o sulla membrana corion-allantoidea. I virus crescono nelle cellule delimitanti le cavità. La moltiplicazione virale si osserva in seguito alla morte dell embrione, o alla comparsa di potere agglutinante nei liquidi embrionali o di lesioni sulla membrana. (virus dell influenza, poxvirus, virus erpetici). Il topino neonato viene ancora usato per l isolamento di alcuni virus (coxsackievirus, togavirus) e viene inoculato per via intracerebrale o intraperitoneale. La moltiplicazione virale si appalesa con segni morbosi (tremori, paralisi, rigidità) o morte dell animale.

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15 Titolazione Per stabilire la quantità di virus (titolo virale) in un materiale il metodo più usato consiste nella determinazione del titolo infettante del materiale in esame (che è direttamente proporzionale al numero di virioni completi presenti). Metodo Diretto: attraverso la conta in un monostrato di cellule delle placche di citolisi o delle lesioni provocate sulla membrana corionallantoidea (poxvirus ed herpesvirus) prodotte da una sospensione virale diluita (in serie logaritmica).

16 Titolazione con metodo indiretto: attraverso il calcolo con semplici metodi statistici del numero di dosi infettanti il 50% degli ospiti inoculati presenti per unità di volume, attraverso l individuazione della diluizione massima del materiale (diluito in serie progressiva) capace di provocare un effetto virus-specifico (distruzione cellulare, o morte o comparsa di lesioni negli animali) in almeno uno degli ospiti impiegati.

17 Emoagglutinazione: Molti virus sono provvisti di proteine di superficie in grado di legarsi alla membrana di eritrociti di diverse specie animali formando dei ponti tra gli eritrociti (agglutinazione). Eritrociti agglutinati sedimentano al fondo di provette in modo irregolare occupando tutto il pozzetto rispetto agli eritrociti non agglutinati, che formano sul fondo del pozzetto un dischetto compatto. Differenziazione tra Virus dell influenza (A, B, C) (con l emaglutinina) e i virus erpetici (D) (senza l emaglutinina) Indagine sierologica: Saggio di inbizione dell emoagglutinazione Opportune diluizioni di siero vengono fatte reagire con una quantità nota di virus. Incubazione 1h 37 C, reazione antigene-anticorpo. Aggiunti eritrociti a concentrazioni definite. Presenza di anticorpo: non agglutinazione, assenza di anticorpo:emoagglutinazione.

18 Il titolo emoagglutinante è anch esso proporzionale alla concentrazione di virioni nel campione in esame. Tuttavia, mentre un solo virione infettante può essere evidenziato mediante la titolazione del potere infettante, nei test di emoagglutinazione è necessario un alto numero di particelle virali (es 10 milioni nel caso di virus influenzale) per avere l agglutinazione evidente di un adeguato numero di eritrociti (in genere 0,25 ml di una sopsensione del 1%).

19 Le colture cellulari servono sia ad isolare e moltiplicare i virus, sia ad osservare le alterazioni cellulari dovute all infezione virale e a studiare i meccanismi di replicazione e danno cellulare a livello biomolecolare.

20 Oggi si usano soprattutto colture di cellule cresciute in terreni di coltura arricchiti di aminoacidi, vitamine, siero di sangue e antibiotici (che consentono la riduzione della distruzione delle colture stesse ad opera di contaminazioni microbiche). Per l allestimento di colture cellulari primarie, frammenti di tessuto vengono dissociati mediante trattamento con enzimi proteolitici (tripsina, collagenasi, DNAsi) e messi in piastra. Le cellule di coltura primaria hanno le stesse caratteristiche delle cellule presenti nell organo di origine, sono diploidi, e possono essere mantenute in vitro mediante passaggi seriali (staccate con tripsina) per una decina di generazioni al massimo, andando poi incontro a senescenza cellulare e morte.

21 Alcune cellule, in genere di origine tumorale o prodottesi per mutazione di uno stipite diploide, diventano capaci di riprodursi illimitatamente in vitro (immortalizzazione), dando origine a una linea cellulare, con corredo aneuploide. Alcune linee cellulari (HeLa, Kb, Hep2) allestite da carcinomi umani sono molto usate nello studio dei virus umani. Le cellule in coltura sono in genere o sottili e allungate dette similfibroblastiche, o poligonali dette similepiteliali. Le cellule possono essere conservate per anni mediante congelamento. Sospensioni di cellule vengono mescolate con glicerolo o dimetisulfossido e portate gradualmente a temperature molto basse (-80ºC o in azoto liquido, -196ºC).

22 Establishment of human adult astrocyte cultures - Tissue was collected from autopsy (3hr post-mortem) or biopsy ( 24hr) - Divided in white and in grey matter - incubated in HBSS medium + trypsin +EDTA +glucose+dnase for 40 minutes in shaker water-bath at 37 C. - To remove meningeal and blood macrophage cells, cell suspensions were plated in uncoated 175 cm2 flasks for 2 h in incubator 37 C. - Supernatants containing suspension cells were transferred to 25cm2 poly-l-lysine-coated flask and left in incubator at 37 C for several days. brain tissue of frontal pole (cortex-subcortex region) Separation of neural cells from adherent cells primary cell culture: outgrowth of adherent cell colonies - The cells were able to proliferate for 12 passages and could be frozen and recultured Expansion Phase Vimentin GFAP Detection of astrocyte marker antigens

23 Microscopia a piccolo ingrandimento

24 Normal and poliovirus-infected monkey kidney cells in culture (cells neither fixed nor stained; *150). A: Monolayer of normal unstained monkey kidney cell in culture. B: Unstained monkey kidney cell culture showing early stage of cytopathic effect typical of poliovirus infection. Approximately 25% of the cytopathic effect (especially rounding) indicative of virus multiplication (1+ cytopathic effect score). C: Unstained monkey kidney culture illustrating more advancedcytopathic effect (3+ to 4+ cytopathic effect). Almost 100% of the cells are affected, and most of the cell sheet has come loose from the wall of the culture tube. (From ref. 207, with permission.)

25 In situ hybridization detection of the location of viral nucleic acids in infected cells. Monkey cells infected with HSV-1 were fixed in formaldehyde, permeabilized in acetone, and incubated with biotin-labeled HSV DNA. The cultures were heated to denature the cellular DNA and the probe, and the culture and solution were allowed to cool. The cells were then reacted with mouse anti-icp4 monoclonal antibody followed by rhodamineconjugated goat antimouse immunoglobulin antibody and fluorescein-conjugated avidin. A: Rhodamine fluorescence showing the location of the HSV trans-activator protein ICP4. B: Fluorescein fluorescence showing the location of HSV DNA in the infected cells. Micrograph courtesy of S. Rice.

26 Altered localization of viral proteins in cells infected with recombinant SV5 expressing an HN protein with a truncated cytoplasmic tail. In wild-type recombinant SV5 (rsv5)-infected cells, HN was found in highly localized patches on the cell surface, and it is likely that these patches are the sites of budding virus. In contrast, in cells infected with rsv5 HNd2 9, a recombinant SV5 lacking residues two to nine of the HN cytoplasmic tail, a striking redistribution of the HN staining pattern was observed, with HN being distributed all across the cell surface. Concomitant with the altered HN staining pattern in cells infected with rsv5 HNd2 9, a redistribution of the M protein straining pattern was observed. The similarity of HN and M staining patterns suggests that targeting of M protein into presumptive budding sites at the cell surface depends on the presence

27 Electron micrographs of virions and infected cells. A: Purified St. Louis encephalitis (SLE) virus negatively stained with ammonium molybdate (472). Surface projections appear as a very thin, indistinct layer. (Courtesy of Dr. Frederick A. Murphy.)B: Thin section of a BHK-21 cell at 48 hours after infection showing SLE virions in the cisternae of the endoplasmic reticulum (765). (Courtesy of Frederick A. Murphy, Sylvia G. Whitfield, and A. K. Harrison.) C: Paracrystalline array of SLE virus in a Culex pipiens mosquito salivary gland cell 25 days after blood-meal-feeding on an infected suckling mouse. (Courtesy of Sylvia G. Whitfield, Frederick A. Murphy, and W. Daniel Sudia.) D: Classical swine fever virus (CSFV) virions negatively stained with uranyl acetate. (Courtesy of Dr. Frank Weiland.)E: Ultrathin section of STE cells infected with CSFV and immunostained with Erns-specific monoclonal antibody (MAb) 24/16 and colloidal gold. Bar = 100 nm. (From ref. 746, with permission.) F: Thin section showing virus-like particles (arrows) in HPBALL cells harvested 14 days after infection with HCV (632). Particles measured approximately 50 nm in diameter. (Courtesy of Dr. Yokho Shimizu.)

28 Electron micrograph of vesicular stomatitis virus (VSV), negatively stained with phosphotungstic acid. Disrupted virions show the helical nucleocapsid core. The surface of intact virions shows protruding glycoprotein spikes.

29 Electron micrographs of representative virion particles.

30 Figure 7-9 Electron microscope visualization of nuclear inclusion areas. The filled triangles denote the electron-translucent nuclear inclusion area in a human HEp-2 cell infected with HSV-1. The filled arrows indicate full capsids, and the unfilled arrows indicate empty capsids. The unfilled triangles indicate host chromatin compressed to the periphery of the nucleus, apparently by the nuclear inclusion. Micrograph courtesy of D. Furlong and B. Roizman.

31 Electron microscope visualization of cytoplasmic factories in a cell infected with reovirus. Micrograph courtesy

32 Microscopia elettronica Formazione di vacuoli in macrofagi infetti con HIV-1 HIV-1 budding durante infezione di un linfocita

33 Microscopia elettronica HIV budding durante un infezione di un linfocita

34 Microscopia elettronica Formazione di vacuoli in macrofagi infetti con HIV

35 Diagnostica molecolare infezioni virali Analisi qualitativa e quantitativa degli acidi nucleici virali: viremia per HIV, HBV, HCV Metodiche: PCR, RT-PCR, NASBA Analisi genotipica delle resistenza ai farmaci in particolare per HIV, HBV, HCV Metodiche: sequenziamento DNA, interpretazione algoritmica Terapia antivirale genotipo guidata

36 Metodiche Molecolari La rivelazione degli acidi nucleici virali è un altro saggio che può essere utilizzato sia per verificare la presenza di un virus in un determinato campione biologico, sia per studiare in maniera dettagliata le fasi del suo ciclo di replicazione.

37 Ricerca diretta degli acidi nucleici virali E possibile eseguire tale rivelazione se si seguono le seguenti condizioni: 1) l acido nucleico virale deve poter essere estratto dai campioni biologici su cui si vuol eseguire il saggio (colture cellulari, biopsie, siero, ecc.) 2) deve essere disponibile una sonda di acido nucleico per l identificazione del virus.

38 IBRIDAZIONE I Saggio che prevede di trattare il materiale estratto dal campione con una sonda oligonucleotidica con una sequenza complementare alla regione virale specifica che si vuole identificare. La sonda è sempre marcata o con un isotopo radioattivo, o con un marcatore enzimatico, fluorescente o chemioluminescente.

39 Tecniche di ibridazione

40 IBRIDAZIONE II Northern blot analisi effettuata su RNA (genomico o RNAm). Southern blot analisi effettuata su DNA. In entrambi i casi il saggio prevede estrazione, purificazione e denaturazione del DNA o RNA e una corsa elettroforetica che comporta la separazione degli acidi nucleici virali in base alla loro lunghezza, seguita da un trasferimento su filtri idonei a far avvenire la successiva fase di ibridazione.

41 Southern blot

42 Saggi di amplificazione degli acidi nucleici Reazione di amplificazione a catena (PCR) permette di amplificare (DNA-polimerasi) un determinato frammento di acido nucleico. Cicli ripetuti di denaturazione, ibridazione e polimerizzazione fanno sì che la sequenza virale, se presente, venga amplificata in maniera esponenziale. Trattando il materiale estratto con trascrittasi inversa per trascrivere l RNA in DNA, la PCR può essere usata anche con virus a RNA (RT-PCR).

43 Schematic of PCR Each cycle doubles the copy number of the target

44 PCR: Amplificazione DNA Primers dntps DNA polimerasi DNA

45 PCR E realizzata ripetendo più cicli di amplificazione (20-40 cicli) -Denaturazione : Separazione delle due eliche di DNA (95 C), 30 sec. da amplificare -Ibridazione: (55 60 C), 30 sec. -Estensione: (72 C), tempo variabile a seconda della grandezza dell amplificato. I primers si ibridano con le sequenze complementari del DNA target Sintesi dei due nuovi filamenti di DNA complementari alla sequenza bersaglio mediante la DNA polimerasi

46 PCR: Analisi del prodotto di amplificazione 1) Gel di agarosio al 2%. 2) Elettroforesi: 100~150 volt. 3) Analizzare su un transilluminatore UV la banda del prodotto di amplificazione

47 PCR: Analisi del prodotto di amplificazione M C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 200 bp

48 Informazioni importanti!!! L'uso della PCR nella routine richiede una cura particolare nell'evitare contaminazioni da amplificati di DNA, attraverso l'adozione di pratiche laboratoristiche rigorose. L approccio migliore all uso della PCR nella routine è quello di adottare pratiche di laboratorio adeguate: separazione rigorosa dei reagenti pre e post amplificazione; linee guida specifiche per il campione manipolato; il personale laboratoristico dovrebbe essere costantemente cosciente delle fonti di contaminazione possibili: - carryover da campione a campione - contaminazione inavvertita dei campioni durante l aliquotazione e la distribuzione - presenza di sequenze bersaglio clonate nei laboratori che hanno isolato e caratterizzato le stesse sequenze che ricercano. L approccio migliore in assoluto è quello di includere reazioni di controllo negative per ognuno dei passaggi principali nel trattamento dei campioni.

49 PCR: Limiti PCR - Falsi positivi - Analisi qualitativa Nuove prospettive PCR real-time - Analisi quantitativa Una PCR quantitativa permette di determinare in un campione la quantità di DNA presente per unità di volume.

50 PCR real-time Utilizza un sistema che permette l amplificazione e la quantificazione ON-LINE con rilevazione in fluorescenza dei prodotti di PCR L amplificazione e la rilevazione fluorescente avvengono all interno dello stesso capillare (in vetro borosilicato) eliminando il problema della contaminazione

51 PCR real-time DNA polimerasi dntps Primers Sonde fluorescenti DNA

52 PCR real-time E in grado di analizzare diversi tipi di fluorescenza emessa da: FLUOROFORI INTERCALANTI IL DNA (SYBR GREEN) SONDE DI IBRIDAZIONE (FRET) SONDE DI IDROLISI (TAQMAN) Rapidità di esecuzione : 20 per 30 cicli

53 PCR real-time: Analisi quantitativa Monitorare real timeon line l andamento della reazione di amplificazione

54 PCR real-time time: : Vantaggi Semplicità di automazione Flessibilità Rapidità di esecuzione Elevate sensibilità e specificità Elevata riproducibilità

55 Analisi quantitativa

56 NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) Utilizzando 3 enzimi (RNA polimerasi T7, RT, RNASi H) e 2 primer specifici si consente l amplificazione sia di RNA sia di DNA in maniera esponenziale. Si basa sullo schema di trasferimento dell informazione genica caratteristico del meccanismo di replicazione dei genomi dei retrovirus: da RNA a DNA e, di nuovo, RNA. Si usa contemporaneamente la miscela di enzimi che funzioneranno a temperatura costante per ottenere la replicazione dell acido nucleico.

57 Due oligo, uno (A) funziona come molecola ibrida con due distinti domini e funzioni: la prima è complementare alla sequenza target, mentre la seconda contiene un promotore per una RNA polimerasi. I enzima RT che sintetizza DNA a partire dall RNA. Ibrido RNA_DNA. II enzima RNAsi-H degrada RNA e quindi il secondo oligo (B) si lega al DNA ed inizia la sintesi del cdna. III enzima T7 RNA polimerasi (DNA dipendente) trascrive il doppio filamento di DNA partendo dal promotore presente sul primo ibrido primer. Il prodotto della reazione NASBA è un RNA a singolo filamento, che rappresenta volte la sequenza bersaglio, sembra fornire maggiori garanzie di specificità.

58 branched DNA Utilizzando speciali sonde chemioluminescenti ibridazione sensibile che amplifica il segnale di rivelazione in maniera lineare. Questa tecnica offre la possibilità di quantificare gli acidi nucleici virali riducendo i rischi di contaminazioni. Vengono utilizzati per studiare pazienti in corso di infezione da HIV, HBV, HCV.

59 Amplificazione del segnale: branched DNA Metodo quantitativo che utilizza speciali sonde chemioluminescenti che si legano specificatamente alla sequenza di acido nucleico da identificare, creando una struttura ramificata branched DNA (bdna). Il segnale ottenuto alla fine della reazione è proporzionale alla quantità di bersaglio presente nel campione. Quantifica sia DNA che RNA: l acido nucleico legato ad un set di sonde specifiche (ibridazione) sul pozzetto di una micropiastra; un altro set di sonde, con una sequenza complementare ad un altra porzione del target, viene utilizzato per la rivelazione. A queste sonde vengono successivamente legate le molecole di DNA ramificate, che amplificano il segnale generato da ciascuna molecola target. L aggiunta di sonde marcate con fosfatasi alcalina, complementari a tre diversi siti di legame su ciascun ramo della molecola, e di un substrato chemiluminescente genera emissione di luce.

60 I step) LISI VIRALE E CATTURA DEL TARGET Lisi virale RNA o DNA target Rilascio genoma Capture Probes e Target Probes con sequenze complementari al target Capture Probes e Target Probes si ibridano al target e Target RNA or DNA Target Probes * si legano al fondo del micropozzetto ricoperto. Capture Probes Solid Phase Capture Probes Microwell * components containing Iso-C/Iso-G

61 II) PREAMPLIFICAZIONE Ogni Preamplifier si ibrida a 2 Target Probes Preamplifiers* Target RNA or DNA Target Probes * Capture Probes Solid Phase Capture Probes Microwell * components containing Iso-C/Iso-G

62 III) AMPLIFICAZIONE Amplifiers* L Amplifier si lega al Preamplifier Preamplifiers* Target RNA or DNA Target Probes* Capture Probes Solid Phase Capture Probes Microwell * components containing Iso-C/Iso-G

63 IV) IBRIDAZIONE DELLA SONDA MARCATA Amplifiers * with hybridized Label Probes* Sonde marcate con Fosfatasi Alcalina si legano agli Amplifier Target RNA or DNA Preamplifiers * Target Probes * Capture Probes Solid Phase Capture Probes Microwell * components containing Iso-C/Iso-G

64 V) GENERAZIONE DEL SEGNALE Amplifiers * with hybridized Label Probes* La luce ottenuta dall idrolisi del diossietano condotta dalla F.A. è proporzionale alla concentrazione iniziale del target Target RNA or DNA Preamplifiers * Target Probes * Capture Probes Solid Phase Capture Probes Microwell * components containing Iso-C/Iso-G

65 Applicazioni delle tecniche di amplificazione degli acidi nucleici

66 Sequenziamento Il sequenziamento dei prodotti amplificati può fornire una valida informazione sia sull identità di un virus il cui acido nucleico è stato amplificato sia sulla presenza di mutanti virali associati a resistenza ai farmaci antivirali. La sua principale applicazione nella diagnostica virale è il rilevamento del sottotipo virale (HBV, HCV, HPV, HIV) e della resistenza ai farmaci anti-hiv e anti-hbv da campioni di plasma da pazienti trattati in fallimento terapeutico.