Dicroismo circolare e chiralità. Una molecola si dice chirale se non è sovrapponibile alla sua immagine speculare.

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1 Dicroismo circolare

2 Dicroismo circolare e chiralità Una molecola si dice chirale se non è sovrapponibile alla sua immagine speculare.

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5 Dicroismo circolare e chiralità Le molecole chirali assorbono in modo diverso la luce polarizzata circolarmente destra e sinistra (dicroismo circolare). A L A R Gli spettri di dicroismo circolare sono spettri differenziali, che misurano questa differenza di assorbimento (ΔA). Queste differenze sono in genere molto piccole (ΔA/A~0.0001) Per motivi essenzialmente storici, spesso si riportano i dati sotto forma di ellitticità, una grandezza proporzionale al ΔA, che si misura in gradi. θ(gradi) = ΔA

6 Ellitticità molare Ovviamente, anche per ΔA vale la legge di Lambert e Beer. ΔA = Δε C l Allo stesso modo si può definire l ellitticità molare [θ]. θ= [θ] C l Sempre per motivi storici, in genere [θ] non si riporta in gradi M 1 cm 1, ma in gradi cm 2 dmole 1. θ mgradi; C M=mol l 1 =mol dm 3 ; l cm [θ]= θ/cl mgradi dm 3 cm 1 mol 1 mgradi gradi 10 3 ;dm 3 cm ; mol dmol 10 [θ] (gradi cm 2 dmol 1 )= θ(mgradi)/[10 C(M)l(cm)] Nel caso di omopolimeri in cui il cromoforo sia nel monomero (ad esempio catene polipeptidiche), conviene riferirsi alla concentrazione di monomeri anziché a quella di polimero.

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9 Assorbimento di una radiazione polarizzata linearmente

10 Assorbimento di una radiazione polarizzata circolarmente

11 Rifrangenza per una radiazione polarizzata linearmente

12 Rifrangenza per una radiazione polarizzata circolarmente

13 Effetto del dicroismo circolare su una polarizzazione lineare

14 Effetto della birifrangenza circolare su una polarizzazione lineare

15 Effetto della birifrangenza e del dicroismo circolare su una polarizzazione lineare

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17 Apparato sperimentale Sorgente Monocromatore Campione Rivelatore Modulatore fotoelastico Il modulatore fa variare periodicamente la luce dalla polarizzazione circolare destra alla sinistra. La luce rivelata oscilla tra I L e I R. I L = I 0 10 A L I I R = I 0 10 A R Dall ampiezza dell oscillazione si risale a ΔA. t

18 Dicroismo circolare e conformazioni Nel caso delle molecole biologiche, l informazione sulla configurazione non è interessante (già si conosce!). Vogliamo studiare la conformazione. A causa dell interazione tra cromofori, il dicroismo circolare è molto sensibile anche alla conformazione!

19 CD di proteine: lontano UV Nel lontano UV (λ<250 nm) l assorbimento (e quindi il CD) è dovuto principalmente ai legami peptidici. Diverse strutture secondarie causano una diversa interazione tra legami peptidici vicini, influenzando fortemente lo spettro CD. α β disordinata

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21 CD di proteine: lontano UV Effettuando la deconvoluzione dello spettro di una proteina come somma degli spettri delle diverse strutture secondarie è possibile determinarne la frazione. A mostly helical protein, myoglobin (in red), two mostly beta sheet proteins, concanavalin A (blue) and beta lactoglobulin (cyan), and a polyproline rich protein, collagen (orange).

22 Dicroismo circolare e conformazioni

23 CD di proteine: lontano UV Si seguono con elevata sensibilità tutti i cambiamenti di conformazione: Denaturazione Processi di associazione

24 CD di proteine: lontano UV

25 CD di proteine: lontano UV Il CD è un metodo semplice e rapido per verificare la struttura di proteine ricombinanti o di mutanti.

26 Dicroismo circolare indotto Un cromoforo achirale (che quindi ha uno spettro dicroico piatto), può assumere un dicroismo indotto se interagisce con un intorno chirale (es. proteina). Molto utile per seguire processi di associazione. Fornisce informazioni locali, anziché globali

27 CD di proteine: vicino UV L assorbimento nel vicino UV (λ>250 nm) è dominato dalle catene laterali aromatiche. Questi cromofori danno origine ad un CD indotto, molto sensibile all intorno. Il CD nel vicino UV fornisce informazioni sulla struttura terziaria intorno alle catene aromatiche.

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29 CD di proteine: visibile L assorbimento nel visibile è dovuto ad eventuali gruppi prostetici (es. eme). Questi cromofori danno origine ad un CD indotto.. Il CD nel visibile fornisce informazioni sulla struttura terziaria intorno gruppo prostetico.

30 CD di acidi nucleici In questo caso i cromofori sono le basi (la catena principale assorbe solo sotto 150 nm). Assorbimento e CD dipendono dalla sequenza oltre che dalla conformazione!

31 CD di acidi nucleici Il CD può comunque essere utilizzato per seguire cambiamenti conformazionali (denaturazione, processi di associazione).

32 Condizioni sperimentali Il rapporto segnale/rumore migliore si ottiene per assorbanza della molecola otticamente attiva 1 (idealmente 0.87). Qualunque assorbimento del solvente, tampone, sali, stabilizzanti deve essere minimizzato. Per il lontano UV conviene usare cammini ottici <0.1 cm. Bisogna flussare lo strumento con azoto per evitare che l ozono prodotto dalla lampada danneggi l ottica, e per eliminare l assorbimento dell aria nel lontano UV.

33 Condizioni sperimentali Evitare (o minimizzare): Cl, DTT, EDTA, HEPES, PIPES. Tamponi migliori: fosfato, tris.