Indice. Prefazione MODULO A DALLA SCOPERTA DEL DNA AL CODICE GENETICO E STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI 1

Transcript

1 Indice Prefazione V MODULO A DALLA SCOPERTA DEL DNA AL CODICE GENETICO E STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI 1 Capitolo 1 Introduzione alla Biologia Molecolare Che cos è la Biologia Molecolare? Il gruppo del fago e la nascita della Biologia Molecolare Dalla scoperta del DNA alla dimostrazione del suo ruolo come materiale genetico 6 Letture di approfondimento 12 Siti web 12 Capitolo 2 Struttura degli acidi nucleici Struttura fisica del DNA: la scoperta della struttura a doppia elica Struttura fisica del DNA: i parametri strutturali della doppia elica 22 Stabilità della doppia elica di DNA in soluzione 23 Strutture alternative e strutture superiori degli acidi nucleici Topologia del DNA e DNA topoisomerasi 35 DNA topoisomerasi Struttura dell RNA Letture di approfondimento 58 Capitolo 3 - Codice genetico Il dogma centrale e prime ipotesi sul codice genetico Decifrazione del codice genetico Mutazioni a soppressione e codice genetico 64

2 VIII Indice 3.4 Struttura del codice genetico e sue proprietà Origine ed evoluzione del codice genetico Letture di approfondimento 72 MODULO B ORGANIZZAZIONE ED EVOLUZIONE DI GENI, CROMOSOMI E GENOMI 73 Capitolo 4 Impacchettamento del DNA genomico: cromosomi e cromatina Impacchettamento dei genomi virali Impacchettamento del genoma batterico Organizzazione e impacchettamento del DNA eucariotico Cromatina interfasica e cromosomi mitotici Organizzazioni atipiche di cromosomi e genomi 82 Cromosomi a spazzola 82 Cromosomi politenici 82 Micronucleo e macronucleo dei ciliati Centromeri Telomeri Nucleosomi e proprietà funzionali della cromatina 88 Posizionamento in fase (phasing) dei nucleosomi 95 Nucleosomi e replicazione del DNA 97 Nucleosomi e trascrizione dei geni 97 Modificazioni post-traduzionali degli istoni e modulazione dell attività trascrizionale della cromatina 99 Letture di approfondimento 101 Capitolo 5 I genomi procariotici ed eucariotici Era genomica Genomi procariotici 102 Caratteristiche, struttura e plasticità dei genomi procariotici 102 Contenuto genico e composizione in basi dei genomi procariotici 105 Geni non codificanti proteine ed elementi mobili nei genomi procariotici 106 Applicazioni della genomica microbica Genomi eucariotici 108 Struttura e organizzazione dei genomi eucariotici 108 Caratteristiche composizionali dei genomi eucariotici 109 Contenuto genico dei genomi eucariotici 110 Caratteristiche dei geni eucariotici 111 Ruolo degli introni nell evoluzione dei geni eucariotici 111 Gli pseudogeni 113 Sequenze ripetute dei genomi eucariotici 115 DNA satellite o altamente ripetitivo 116 DNA mediamente ripetitivo: microsatelliti e minisatelliti 118 Sequenze di DNA ripetitivo intersperse nel genoma 121 Duplicazioni segmentali 123 Famiglie geniche 124 Geni reiterati ed evoluzione parallela Genoma mitocondriale Genoma dei cloroplasti 130

3 Indice IX 119 Letture di approfondimento 130 MODULO C REPLICAZIONE E MANTENIMENTO DEL GENOMA 131 Capitolo 6 Replicazione del DNA Replicazione semiconservativa del DNA 134 Esperimento di Meselson e Sthal Modello del replicone Identificazione delle origini di replicazione 138 Origine di replicazione di Escherichia coli 139 Origini di replicazione negli eucarioti 140 ARS del lievito Saccharomyces cerevisiae 142 Origini precoci e origini tardive: influenza della struttura del cromosoma Meccanismo della replicazione 145 Isolamento di mutanti letali-condizionali di E. coli alterati nella replicazione del DNA 148 Replisoma di Escherichia coli 149 Scoperta della DNA polimerasi e sue proprietà biochimiche 151 Fedeltà di replicazione del DNA 153 Forcella di replicazione: sintesi del filamento continuo e del filamento discontinuo 155 Innesco della sintesi di DNA 155 Saggi di complementazione in vitro 157 Proteine replicative di Escherichia coli Meccanismo della replicazione del DNA negli eucarioti 165 Isolamento di proteine replicative negli eucarioti 167 Sistemi di ricostituzione in vitro del processo di replicazione 167 Sintesi di DNA translesione Problema della replicazione dei telomeri nella replicazione delle molecole di DNA lineari 171 Influenza della struttura della cromatina e del ciclo cellulare nel controllo della replicazione del DNA negli eucarioti 174 Meccanismo che controlla la replicazione del DNA durante il ciclo cellulare Letture di approfondimento 177 Capitolo 7 Riparazione del DNA Mutazioni Sistemi di riparazione del DNA 181

4 X Indice Riparazione per escissione delle basi (BER) 185 Riparazione per escissione di nucleotidi (NER) 188 Riparazione di errori replicativi (MMR) 190 Meccanismi di tolleranza al danno (PRR) 191 Riparazione di danni al DNA tramite ricombinazione Risposta cellulare a danni sul DNA e connessioni tra riparazione e ciclo cellulare 194 Aspetti generali del ciclo cellulare 194 Motore del ciclo cellulare 197 Checkpoint attivato da danni al DNA e sue interconnessioni con il meccanismo di cancerogenesi Letture di approfondimento 204 Capitolo 8 Ricombinazione Introduzione e ricombinazione in meiosi Ricombinazione omologa o generalizzata 206 Ricombinazione sito-specifica Trasposizione Letture di approfondimento 222 MODULO D TRASCRIZIONE E SUE REGOLAZIONI 223 Capitolo 9 Trascrizione nei procarioti RNA polimerasi Le tre fasi della trascrizione 228 Struttura della RNA polimerasi 230 Fase di inizio della sintesi dell RNA 233 Distacco dal promotore e allungamento dell RNA 234 Promotori e il fattore sigma 235 Diversi fattori sigma controllano promotori diversi 238 Topologia e trascrizione 240 Terminazione della trascrizione nei procarioti 240 Antiterminazione 242 Terminatori e attenuazione 244 Letture di approfondimento 245 Capitolo 10 Regolazione della trascrizione nei procarioti Elementi di controllo nella trascrizione dei procarioti 246 Attivatori trascrizionali, repressori e operatori 246 Organizzazione degli operoni procariotici Operone lac 249 Controllo negativo dell operone lac 249 Controllo positivo dell operone lac e ruolo di CAP 255

5 Indice XI Interazione della regione promotore/operatore con CAP, repressore lac ed RNA polimerasi 256 Motivi strutturali comuni di CAP e del repressore lac 258 Repressore lac Attivazioni e modificazioni allosteriche Operone del triptofano 262 Regolazioni a livello di terminazione della trascrizione Controllo dell espressione genica nel fago lambda 266 I due cicli vitali del fago lambda: ciclo litico e ciclo lisogenico 267 Regione di controllo del fago 270 Struttura del repressore e di Cro 273 Legame cooperativo del repressore al DNA 277 Induzione del ciclo litico di lambda in un batterio lisogenico 279 Regolazione dalla proteina CII come attivatore della trascrizione 279 Controllo dell integrazione e dell escissione del fago nel cromosoma di E. coli Letture di approfondimento 286 Capitolo 11 Trascrizione e regolazione negli eucarioti Tre sistemi di trascrizione nel nucleo Promotore dei geni per gli rrna e fattori che regolano la trascrizione della RNA polimerasi I RNA polimerasi III: promotori di Pol III interni ed esterni e suoi fattori di trascrizione RNA polimerasi II: struttura del promotore minimo di Pol II 293 Fattori basali di Pol II e assemblaggio del complesso d inizio 295 Ruolo del mediatore nella trascizione di Pol II 298 Struttura di Pol II e reazione di allungamento nella sintesi dell RNA Regolazione 303 Struttura modulare dei promotori eucariotici Struttura modulare e domini dei fattori di trascrizione (trans-attivatori) Domini funzionali dei transattivatori: domini di legame al DNA 311 Elica-giro-elica (helix-turn-helix) 311 Omeodominio 312 Dominio a dita di zinco 312 Domini a cerniere di leucina (leucine zipper) 314 Dominio elica-ansa-elica (helix-loop-helix) 316 Controllo combinatoriale della trascrizione 317 Reclutamento del complesso di trascrizione 319 Attivatori e cromatina 320 Attivazione e segnali 322 I recettori degli ormoni sterodei 323 Risposta all AMP ciclico e fattore CREB 323 Fattore trascrizionale NF-kB Letture di approfondimento 324

6 XII Indice MODULO E PROCESSAMENTO E MATURAZIONE DELL RNA 327 Capitolo 12 Maturazione mediante tagli endonucleolitici ed esonucleolitici Processamento degli rrna nei procarioti e negli eucarioti Processamento dei trna nei procarioti e negli eucarioti Ribozimi autocatalitici a testa di martello Maturazione dei microrna 335 Letture di approfondimento 337 Capitolo 13 Modificazioni chimiche dell RNA Modificazioni chimiche degli rrna eucariotici Aggiunta del cap agli mrna eucariotici Poliadenilazione e terminazione della trascrizione degli mrna eucariotici Funzioni della coda di poli(a) Turnover della coda di poli(a) Poliadenilazione nei procarioti e negli organelli Letture di approfondimento 347 Capitolo 14 Modificazioni delle sequenze nucleotidiche Eventi post-trascrizionali nella maturazione degli mrna eucariotici Splicing dell RNA Meccanismo dello splicing Spliceosoma Introni autocatalitici di gruppo I e II trna splicing Trans-splicing Accoppiamento tra splicing e trascrizione Splicing alternativo Regolazione dello splicing Editing dell RNA Traslocazione nucleo-citoplasmatica degli RNA Letture di approfondimento 373 MODULO F TRADUZIONE E SUE REGOLAZIONI 375 Capitolo 15 Apparato di traduzione e suoi componenti Ribosoma 377 rrna 379 r-proteine 379 Struttura tridimensionale 383 Ribosoma come ribozima RNA transfer (trna, RNA di trasferimento) e amminoacil-trna sintetasi 387

7 Indice XIII 15.3 RNA messaggero (mrna) Letture di approfondimento 396 Capitolo 16 Meccanismo della sintesi proteica Inizio nei procarioti 398 trna di inizio 398 Riconoscimento del sito di inizio sull mrna 400 Fattori di inizio nei procarioti 401 Processo di inizio della traduzione nei procarioti Inizio negli eucarioti 403 Fattori di inizio negli eucarioti 404 Processo di inizio della traduzione negli eucarioti 405 Meccanismo di inizio alternativo cap-indipendente negli eucarioti Allungamento Terminazione Bilancio energetico Velocità e accuratezza della sintesi proteica Traduzione a livello strutturale Letture di approfondimento 420 Capitolo 17 Regolazioni della traduzione Regolazione generale della traduzione 422 Risposta stringente nei procarioti 422 Controllo generale della traduzione negli eucarioti Regolazioni traduzionali di geni specifici 424 Controlli traduzionali autogeni 425 Controlli traduzionali non autogeni Regolazione della stabilità e degradazione degli mrna 431 Degradazione dell mrna nei procarioti 431 Degradazione dell mrna nelle cellule eucariotiche 432 Meccanismi di controllo qualità dell mrna Controllo della traduzione e stabilità degli mrna da parte di RNA regolatori 437 srna procariotici 439 Riboswitch 440 MicroRNA Trasporto e localizzazione degli mrna 443 Localizzazione del mrna di ASH1 in lievito 444 Localizzazione di mrna nell uovo di Drosophila 445 Localizzazione di mrna nei dendriti neuronali Granuli citoplasmatici di RNA Letture di approfondimento 449

8 XIV Indice MODULO G ALTRI LIVELLI DI REGOLAZIONE: MODIFICAZIONI GENOMICHE, EPIGENETICHE E POST-TRADUZIONALI 451 Capitolo 18 Riarrangiamenti genomici come meccanismi di regolazione dell espressione genica Cambiamenti quantitativi delle sequenze genomiche 453 Amplificazione genica 454 Politenizzazione 455 Diminuzione genica, cromatinica e cromosomica 456 Micro- e macronucleolo dei protozoi ciliati Riarrangiamenti delle sequenze DNA 458 Cambiamento della specificità d ospite del fago Mu 458 Variazione di fase di Salmonella 459 Cambiamento del tipo sessuale in lievito (locus MAT) 460 Variazione antigenica in Trypanosoma (geni VSG) 462 Ricombinazione V(D)J nei vertebrati 464 Letture di approfondimento 464 Capitolo 19 Regolazioni epigenetiche: metilazione del DNA e rimodellamento della cromatina Metilazione del DNA ed espressione genica 465 Metilazione del DNA genomico nei mammiferi 466 Isole CpG 467 Metilazione delle CpG e trascrizione 469 Imprinting genetico Rimodellamento della cromatina 472 Modificazioni post-traduzionali degli istoni 473 Complessi di rimodellamento (rimodellatori) ATP-dipendenti 474 Sostituzione di varianti istoniche Letture di approfondimento 476 Capitolo 20 Modificazioni e regolazioni post-traduzionali di proteine Stabilità e processamento di proteine Ubiquitinazione di proteine Sumoilazione di proteine Fosforilazione e defosforilazione di proteine Acetilazione di proteine Metilazione di proteine Glicosilazione e modificazioni lipidiche di proteine 491 Letture di approfondimento 494 MODULO H APPROCCI, TECNICHE E MODELLI IN BIOLOGIA MOLECOLARE 495 Capitolo 21 Tecniche della biologia molecolare Tecniche spettofotometriche per l analisi della denaturazione del DNA 497

9 Indice XV Spettro di assorbimento 497 Denaturazione del DNA, T m 498 Riassociazione del DNA, cinetica di riassociazione, Cot Uso di sonde di DNA per l identificazione e analisi di sequenze nucleotidiche 502 Ibridazione a saturazione 503 Ibridazione in situ o citologica 504 Southern e Northern blot 504 Ibridazione su colonia o su placca 504 Microarray (o microchip) Ultracentrifugazione 508 Sedimentazione in gradienti di saccarosio 508 Gradienti di densità di cloruro di cesio (CsCl) Tecnologie di base per l isolamento e la manipolazione di geni 512 Enzimi di restrizione e DNA ligasi 515 Vettori di clonaggio 520 Plasmidi 521 Trasformazione di cellule di E. coli e selezione dei trasformanti 522 Plasmidi della serie puc: selezione bianco o blu 522 Vettori di espressione e produzione di proteine ricombinanti 524 Batteriofago come vettore di clonaggio 528 Cosmidi 530 Vettori per il clonaggio e l espressione in cellule eucariotiche 530 Vettori di lievito 532 Vettori per il trasferimento genetico in cellule animali 534 Trasferimento di DNA all interno di vegetali Banche di DNA 538 Banche genomiche 538 Rappresentatività di una libreria di DNA genomico 540 Librerie di cdna 540 Identificazione del clone contenente il DNA d interesse da una libreria PCR reazione a catena della polimerasi Determinazione della sequenza nucleotidica del DNA Piattaforme di sequenziamento di nuova generazione Valutazione dell espressione di un gene Inibizione dell espressione di geni specifici: RNA antisenso e interferenza da RNA Interazioni tra macromolecole biologiche 569 Interazioni proteina-dna 570 Interazioni proteina-proteina Letture di approfondimento 583 Capitolo 22 Bioinformatica e genomica Sequenziamento e assemblaggio di genomi completi Sequenziamento del trascrittoma Identificazione e annotazione di geni Identificazione e annotazione di regioni regolatorie Confronto e allineamento di sequenze 592

10 22.6 Annotazione delle sequenze proteiche Banche dati e i browser genomici Evoluzione molecolare Indirizzi web delle principali risorse bionformatiche 599 Capitolo 23 Organismi modello Il lievito Saccharomyces cerevisiae Il moscerino della frutta Drosophila melanogaster Il nematode Caenorhabditis elegans L anfibio Xenopus laevis e il suo successore Xenopus tropicalis Il pesce Danio rerio o zebrafish Il topo comune Mus musculus La pianta Arabidopsis thaliana 628 Letture di approfondimento 629 Indice analitico 631