Acidi Nucleici: DNA = acido deossiribonucleico

Transcript

1 Acidi Nucleici: DNA = acido deossiribonucleico depositario dell informazione genetica RNA: acido ribonucleico trascrizione e traduzione dell informazione genetica dogma centrale della biologia molecolare

2 (deossinucleotidi) (nucleotidi)

3 Gli acidi nucleici sono polimeri lineari di nucleotidi Oligonucleotidi Polinucleotidi

4 Appaiamento complementare delle basi: A-T (2 legami H) C-G (3 legami H) Interazioni di van der Waals tra coppie di basi sovrapposte (impilamento stacking) Per ogni molecola di DNA il contenuto di A è uguale al contenuto di T e il contenuto di C è uguale al contenuto di G (regola di Chargaff)

5 10.5 Coppie di basi per giro - 34 Å - Diametro dell elica uniforme: - 20 Å - Immagine di diffrazione dei raggi X di una molecola di DNA (R. Franklin & M. Wilkins) Filamenti antiparalleli Struttura a doppia elica destrorsa del DNA (Watson e Crick, 1953)

6 MoyC5I

7 Eliche destrorse bp = base pair Kb = migliaia di coppie di basi bp/giro Diametro (Å) Inclinazione basi solco maggiore solco maggiore poco più profondo profondo solco minore solco minore meno profondo stretto e profondo Elica sinistrorsa (favorita da alternanza purine-pirimidine, es: pcgcgcg.)

8

9 Il DNA a doppia elica può essere denaturato

10 La denaturazione si accompagna ad un aumento dell assorbanza a 260 nm: effetto ipercromico

11 a

12 La denaturazione del DNA è un processo reversibile La riassociazione dei filamenti annealing è rapida e avviene in una sola tappa se la separazione è incompleta Se i filamenti sono completamente separati la riassociazione avviene in due tappe: 1) appaiamento di un breve segmento complementare (fase più lenta); 2) rinaturazione completa (fase rapida)

13 La capacità di riassociazione di filamenti polinucleotidici secondo la regola della complementarietà delle basi viene sfruttata in molte tecniche di biologia molecolare Si possono formare ibridi DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA

14 Quanto DNA è contenuto in una cellula?... bp = Base Pair (coppie di basi) lungh DNA/lungh struttura ospitante E. coli: 4,6x10 6 bp (1,7 mm) 850 (unica molecola circolare) Cellula umana: 3,2x10 9 bp (~2 m) ~4x10 5 (46 cromosomi) Modalità di compattamento del DNA: - Superavvolgimento - associazione con proteine in strutture ordinate

15 Superavvolgimento DNA rilassato

16 -Superavvolgimento negativo (rotazione nella direzione opposta all avvolgimento dell elica) -Superavvolgimento positivo (rotazione nella stessa direzione di avvolgimento dell elica) Il superavvolgimento positivo compatta il DNA e rende più difficile la separazione dei filamenti dell elica Il superavvolgimento negativo deriva dal parziale srotolamento della doppia elica e facilita la separazione dei filamenti dell elica Il DNA è mantenuto in uno stato superavvolto perché le catene non sono libere di ruotare su se stesse (DNA circolare, nei procarioti associazione con proteine, negli eucarioti)

17

18 è richiesta la separazione dei filamenti dell elica

19

20 La separazione dei filamenti dell elica induce superavvolgimento positivo

21

22 I superavvolgimenti generati dalla separazione dei filamenti dell elica durante la replicazione o la trascrizione vengono rimossi dalle DNA topoisomerasi

23 Come funzionano le TOPOISOMERASI? TOPOISOMERASI DI TIPO I - Monomeri - Tagliano un singolo filamento - Non consumano ATP TOPOISOMERASI DI TIPO II - Omodimeri (eucarioti) eterotetrameri (batteri) - Tagliano entrambi i filamenti - richiedono ATP Tutte le topoisomerasi formano un intermedio covalente enzima-dna

24 Meccanismo d azione delle topoisomerasi di tipo I

25 EYGrElVyHnU

26 In una cellula umana, 2 m di DNA sono impacchettati in un nucleo di pochi μm di diametro! DNA + proteine = cromatina cromosomi

27 DNA nucleosomale: 146 bp + 60 bp (linker) Istoni: proteine basiche (ricche in Lys e Arg) L interazione con il DNA è di tipo elettrostatico e sequenza-indipendente

28 Livelli di organizzazione della cromatina In una cellula umana, 2 m di DNA sono impacchettati in un nucleo di pochi µm di diametro!

29

30

31 sweg

32 Le modificazioni post-traduzionali degli istoni regolano lo stato di compattazione della cromatina e quindi l accessibilità del DNA all interazione con fattori di regolazione

33 Il legame fosfodiestere può essere idrolizzato da nucleasi (fosfodiesterasi) -Ribonucleasi (RNAasi) -Deossiribonucleasi (DNAasi) -enzimi di restrizione = endonucleasi sequenza-specifiche

34 Il legame fosfodiestere può essere idrolizzato da nucleasi Ribonucleasi (RNAasi) Deossiribonucleasi (DNAasi) endonucleasi

35 enzimi di restrizione = endonucleasi sequenza-specifiche Sequenze PALINDROMICHE nei siti di taglio per gli enzimi di restrizione

36 Biosintesi del DNA: replicazione Caratteristiche: -Semiconservativa -Bidirezionale -Fedele -Semidiscontinua Principali enzimi coinvolti: -DNA polimerasi -DNA ligasi -Primasi -Elicasi -Topoisomerasi

37 Nei procarioti la replicazione del DNA inizia in un unico sito (origine della replicazione) Negli eucarioti la replicazione inizia in più siti Sia nei procarioti che negli eucarioti la replicazione è bidirezionale

38 Inizio della replicazione nei procarioti

39

40 La sintesi delle nuove molecole di DNA è catalizzata da DNA polimerasi LA DNA POLIMERARI CATALIZZA L AGGIUNTA SEQUENZIALE DI UN DEOSSIRIBONUCLEOTIDE ALL ESTREMITA 3 -OH DI UNA CATENA POLINUCLEOTIDICA ACCOPPIATA ADUN FILAMENTO STAMPO -Stampo (DNA) n residui +dntp (DNA) n+1 +PPi -3 -OH libero (innesco/catena in allungamento) -Nucleosidi 5 -trifosfato (tutti e quattro i nucleotidi devono essere presenti) -Mg 2+

41 La sintesi delle nuove molecole di DNA è catalizzata da DNA polimerasi

42 Reazione catalizzata dalla DNA polimerasi Allungamento della catena in direzione 5 3 Attività esonucleasica 3 5 per la correzione degli errori

43

44

45 Che cosa è richiesto per la replicazione del DNA. -Stampo -3 -OH libero (innesco/catena in allungamento) -Nucleosidi 5 -trifosfato (tutti e quattro i nucleotidi devono essere presenti) -DNA polimerasi -Mg 2+ La replicazione è un processo molto accurato (replicazione fedele) Frequenza di errore in E. coli: 1 errore ogni nucleotidi aggiunti (1 errore ogni replicazioni!)

46 Correzione degli errori: attività proofreading 3 5 esonucleasica della DNA Polimerasi I

47 La DNA polimerasi -Sintetizza DNA in direzione 5 3 -Richiede un innesco per la sua attività Problema 1: poiché i due filamenti sono antiparalleli, la crescita dei filamenti neosintetizzati deve avvenire in direzioni opposte

48 Soluzione al problema 1: -Sintesi continua nella direzione di avanzamento della forcella di replicazione (filamento guida/catena veloce) -Sintesi discontinua nella direzione di allontanamento dalla forcella di replicazione (catena lenta: frammenti di Okazaki) La replicazione del DNA è semidiscontinua

49 Problema 2: chi fornisce l innesco?... Soluzione: DNA primasi: è una RNA polimerasi che sintetizza un breve tratto di RNA (circa 10 nucleotidi) complementare allo stampo di DNA (RNA primer). La DNA primasi utilizza ribonucleosidi 5 - trifosfato e catalizza la formazione del legame fosfodiestere liberando PPi La DNA polimerasi aggiunge poi deossiribonucleotidi all estremità 3 -OH del RNA primer La DNA polimerasi utilizza deossiribonucleotidi 5 -trifosfato e catalizza la formazione del legame fosfodiestereo liberando PPi

50 La duplicazione del DNA nei Procarioti La DNA polimerasi I (Pol I) è il principale enzima preposto alla duplicazione in E. coli. Attività polimerasica 5 3 : sintesi DNA Attività esonucleasica 3 5 : correzione basi sbagliate inserite Attività esonucleasica 5 3 : riparazione DNA (rimozione basi in porzioni danneggiate del DNA) N 5 3 esonucleasica 3 5 esonucleasica Polimerasi C

51 Allungamento del primer di RNA ad opera della Pol I Sintesi di un nuovo RNA primer in corrispondenza dell avanzare della forcina

52 Attività esonucleasica 5 3 rimozione frammenti di Okazaki Il primer di RNA all estremità 5 di un frammento di Okazaki viene eliminato grazie all attività esonucleasica 5 3 della Poli I e sostituito mediante la sua attività polimerasica 5 3. Il legame covalente è ripristinato ad opera della DNA ligasi

53 Rimozione del primer e sostituzione con un tratto di DNA da parte della DNA polimerasi I

54 Fase di sintesi/allungamento Limits of DNA polymerase can only build onto 3 end of an existing DNA strand 3 5 Okazaki fragments 3 5 ligase Okazaki Lagging strand 5 growing replication fork Lagging strand Okazaki fragments joined by ligase 3 DNA polymerase III Leading strand Leading strand continuous synthesis

55 Attività esonucleasica 5 3 Riparazione DNA per rimozione di basi (10 basi) in porzioni danneggiate del DNA dall estremità 5 di un DNA a singolo filamento 3 5 idrolisi

56 Quante DNA polimerasi?...replicazione ricombinazione riparazione Processività = numero di nucleotidi aggiunti prima che la polimerasi si dissoci Velocità di replicazione in E. coli = circa 1000 nucleotidi/sec Enzima principale della replicazione riparazione

57 DNA polymerase III 1000 nucleotidi/secondo! main DNA builder DNA polymerase I 20 nucleotidi/second editing, repair & primer removal DNA polymerase III enzyme Thomas Kornberg 1970 Arthur Kornberg 1959

58 Saldatura dei frammenti di Okazaki DNA LIGASI La DNA ligasi catalizza l unione di una catena di DNA la cui estremità libera contiene un gruppo ossidrilico in posizione 3 (3 -OH) con un altra catena la cui estremità libera contiene un gruppo fosforico in posizione 5 (5 -P). Reazione a più passggi 1.Attivazione del gruppo fosforico 5 al punto di interruzione 2. Formazione del legame fosfodiestereo

59 Reazione catalizzata dalla DNA ligasi: 1. Attivazione del gruppo fosforico 5 al punto di interruzione: 1a) trasferimento di AMP ad un residuo di lisina dell enzima (nota: l AMP può derivare dal NAD + o dall ATP)