ANALISI MICROBIOLOGICHE DELLE ACQUE PER USO UMANO Ricerca di Escherichia coli
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1 numero 9 marzo 2009 ANALISI MICROBIOLOGICHE DELLE ACQUE PER USO UMANO Ricerca di Escherichia coli Appartenente alla famiglia delle Enterobacteriaceae, Escherichia coli è il batterio coliforme predominante nel materiale di origine fecale. Rispetto agli altri batteri enterici, ha la particolarità di essere meno sensibile alle procedure di disinfezione. Per queste ragioni, Escherichia coli è stato riconosciuto come indicatore primario di contaminazione fecale delle acque; di conseguenza, per le acque ad uso umano è prescritta l assenza obbligatoria di questo microrganismo. Negli ultimi anni sono stati messi a punto vari metodi analitici per ottenere risultati certi in tempi sempre più rapidi. Sintetizzeremo nelle prossime pagine i metodi più utilizzati, che prevedono la tecnica di filtrazione su membrana, per i quali è in vigore la normativa ISO :2000 (ripresa anche dalla norma Uni EN ISO :2002 e dal Decreto Legislativo n. 31 del 2001), che descrive una metodica normalizzata ed una metodica rapida. In tutti i casi, è previsto dalle norme internazionali il campionamento dell acqua in bottiglie sterili da 500 ml, nelle quali va aggiunto, in caso di acque clorate, sodio tiosolfato al 10% nella quantità di 1 ml (100 mg) per 1 litro di acqua (cod. TS15-D). I materiali da utilizzare nelle varie metodiche sono indicati nelle varie fasi e richiamati nella tabella in calce al testo. 1. METODICA NORMALIZZATA Si possono considerare quattro fasi fondamentali: - Filtrazione del campione - Crescita su terreno agarizzato a 36 C - Subcoltura - Conferma delle colonie 1/5
2 1.1. Filtrazione del campione Il campione di acqua (generalmente un volume di 100 ml per le acque di distribuzione e 250 ml per le acque imbottigliate) viene filtrato sterilmente attraverso una membrana di esteri di cellulosa, grigliata, con diametro di 47 mm e pori di 45 µm (codice ME47NC45100/01). Si utilizza a questo scopo un sistema filtrante collegato ad una pompa a vuoto, facendo attenzione, durante il procedimento, a porre il lato quadrettato della membrana verso l alto Crescita su terreno agarizzato a 36 C La membrana impregnata viene posta, con l ausilio di una pinzetta sterile, sulla superficie del terreno agarizzato Tergitol 7 + TTC (cod. 2249A), quindi si procede all incubazione a 36 ± 1 C per ore (fino ad un massimo di 48 ore). Le colonie di E. coli si evidenziano in quanto conferiscono al terreno una colorazione gialla, con parte centrale aranciata. L incubazione in parallelo di un identico campione a 44 C serve a verificare la presenza di flora interferente. Il controllo qualità in questa fase può esser effettuato con ceppi microbici certificati, utilizzando come controllo positivo Escherichia coli ATCC (cod. MP-GP-E02, MS-E025) e come controllo negativo Enterococcus faecalis ATCC (cod. MP-GP-E03, MS-E014) Subcoltura Per verificare la purezza delle colonie sospette, si effettua una subcultura in Tryptone Soy Agar con apposita formulazione (cod ). Le piastre vengono incubate a 36 ± 1 C per ore e le colonie che si sviluppano vanno sottoposte alle prove di conferma Conferma I microrganismi devono essere differenziati in base alla presenza dell enzima citocromo ossidasi ed alla capacità di produrre indolo. 1.4.a. Prova della citocromo ossidasi Le colonie cresciute su Tryptone Soy Agar vanno prelevate con ansa sterile e strisciate su appositi dischetti impregnati con Reattivo alla Tetrametil-parafenilendiammina dicloridrato (cod ), che in presenza dell enzima porta alla formazione di blu indofenolo. 2/5
3 Escherichia coli è un microrganismo citocromo ossidasi negativo e non svilupperà alcun colore; i microrganismi citocromo ossidasi positivi svilupperanno invece una colorazione blu-violetta. 1.4.b. Prova dell indolo Le colonie cresciute su Tryptone Soy agar vanno prelevate ed inoculate in provette con 3 ml di Tryptophan Culture Broth (cod ), quindi incubate a 44 ± 1 C per ore. Dopo l incubazione, si aggiunge qualche goccia di Reattivo di Kovacs (cod. 5205): Escherichia coli è in grado di produrre indolo a partire dal triptofano e in presenza del reattivo le colonie svilupperanno una colorazione rossa (anello rosso all interfaccia). 2. METODICA RAPIDA La metodica rapida può essere eseguita solo in parallelo con la prova normalizzata. Possiamo considerare quattro fasi fondamentali: - Filtrazione del campione - Crescita su terreno agarizzato a 36 C - Crescita su terreno agarizzato a 44 C - Conferma delle colonie 2.1. Filtrazione del campione La procedura è analoga a quanto descritto nel punto Crescita su terreno agarizzato a 36 C La membrana impregnata viene posta sulla superficie del terreno Tryptone Soy Agar con apposita formulazione (cod ), quindi si procede all incubazione a 36 ± 1 C per 4-5 ore Crescita su terreno agarizzato a 44 C Dopo incubazione in Tryptone Soy Agar, la membrana viene trasferita sulla superficie del terreno Tryptone Bile Soy Agar (cod.20490), quindi si procede all incubazione a 44 ± 1 C per ore Conferma I microrganismi devono essere differenziati in base alla capacità di produrre indolo. Dopo incubazione in Tryptone Bile Soy agar, la membrana viene perciò trasferita su un disco imbevuto con Reattivo alla p-dimetilaminobenzaldeide (cod ). Le colonie di Escherichia coli, indolo positive, assumeranno una colorazione rossa in pochi minuti. 3/5
4 Terreni di coltura e reagenti ISO :2000, tutti i prodotti nel catalogo Kairosafe Membrane filtranti e flaconi Codice Descrizione Formato TS15-D Flaconi sterili da 500 ml con 50 mg sodio tiosolfato 100 pz ME47NC45100/01 Terreni di Coltura e Reattivi Membrana filtrante sterile, grigliata, 47 mm, pori 0,45 µm, conf. singola 100 pz 2249A Tergitol 7 + TTC Agar 10 piastre 60 mm Tryptone Soy Agar 20 piastre 90 mm Dischi con reattivo per citocromo ossidasi 50 dischi Tryptophan Culture Broth 10 provette da 3 ml 5205 Reagente di Kovacs 1 flacone da 100 ml Tryptone Soy Agar 10 piastre 60 mm Tryptone Bile Soy Agar 10 piastre 60 mm Dischi con reattivo per indolo 50 dischi I terreni di coltura sono disponibili anche in formato disidratato, con i supplementi necessari Ceppi microbici di controllo ISO :2000, tutti i prodotti nel catalogo Kairosafe Ceppi di controllo Codice Ceppo liofilizzato ATCC * Controllo Confezione 1 MP-GP-E02 Escherichia coli Positivo 5 MicroPellets MS-E025 Escherichia coli Positivo 2 Microswabs MP-GP-E03 Enterococcus faecalis Negativo 5 MicroPellets MS-E014 Enterococcus faecalis Negativo 2 Microswabs 1 MicroSwabs: Sistema costituito da una provetta di plastica con tappo a serbatoio a cui è applicato un tampone ovattato. Il pellet di microrganismi si trova sul fondo della provetta mentre il liquido di ricostituzione è all'interno del tappo/serbatoio e viene fatto defluire con un semplice movimento. Il tampone permette lo striscio diretto sui terreni in piastra. Il pellet contiene un minimo di 1000 UFC. MicroPellets: Sistema costituito da un pellet liofilizzato e da 1 ml di soluzione reidratante. Il pellet, una volta reidratato, dà origine ad una sospensione a titolo noto ( CFU / 0.1 ml), permettendo una semina quantitativa. * The ATCC Licensed Derivative emblem, the ATCC Licensed Derivative word mark and the ATCC catalog marks are trademarks of ATCC used under license. Kairosafe is licensed to use these trademarks and to sell licensed products manufactured for Mecconti using ATCC materials derived from ATCC cultures. Look for the ATCC Licensed Derivative emblem for products derived from ATCC cultures. 4/5
5 Per informazioni e richieste: KAIROSafe S.r.l. Sistiana, 41/D Duino Aurisina (TS) Tel/fax: info@kairosafe.it web: 5/5
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