Tecniche di purificazione: cromatografia

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1 Tecniche di purificazione: cromatografia

2 Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativo. Queste tecniche sono basate sulla distribuzione differenziale dei vari componenti fra due fasi, una chiamata fase fissa o fase stazionaria e l altra chiamata fase mobile o eluente, che fluisce in continuo attraverso la fase fissa

3 TECNICHE CROMATOGRAFICHE IN BASE ALLA FORMA DEL LETTO CROMATOGRAFICO Cromatografia su colonna Cromatografia planare (su strato sottile) IN BASE ALLO STATO FISICO DELLA FASE MOBILE Cromatografia liquida (LC) Gascromatografia (GC) IN BASE AL MECCANISMO DI SEPARAZIONE Adsorbimento Ripartizione Scambio ionico (IEC) Esclusione (SEC) Affinità

4 Egli intuì che la separazione era dovuta alla diversa affinità dei componenti per il carbonato di calcio NASCITA DELLA CROMATOGRAFIA Inizi del XX secolo come tecnica per la separazione di pigmenti fogliari, inventata dal botanico russo Mikhail Semenovich Tswett. Egli intendeva separare i pigmenti presenti nella clorofilla; fece un estratto di foglie verdi in etere di petrolio, lo depositò in testa ad una colonna di vetro impaccata con carbonato di calcio ed eluì, (cioè versò in continuo) solfuro di carbonio. I vari pigmenti si separano in bande colorate, in particolare clorofilla A e B, carotene e xantofilla

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9 Un alto valore di K indica una maggiore affinità per la fase stazionaria (C). il composto si sposterà più lentamente lungo la colonna Un basso valore di K indica una maggiore affinità per la fase mobile (A). il composto si sposterà più velocemente lungo la colonna Grazie a questo avviene la separazione dei tre componenti C B A

10 I QUATTRO CONCETTI DI BASE IN CROMATOGRAFIA K : fattore di capacità α : Selettività N : efficienza del sistema R : risoluzione

11 I QUATTRO CONCETTI DI BASE IN CROMATOGRAFIA K : fattore di capacità Il fattore di capacità di un composto è il suo volume di eluizione (tempo) rispetto al volume di eluizione (tempo) di un composto non trattenuto K = (Rt analita - Rt non trattenuto ) Rt non trattenuto Il fattore di capacità è simile ad una costante di equilibrio. Rappresenta la misura del tempo trascorso in/sopra la fase stazionaria rispetto al tempo di residenza nella fase mobile durante il passaggio attraverso la colonna. Maggiore è il fattore di capacità maggiore è il tempo trascorso in fase stazionaria e più tardi il composto eluirà dalla colonna.

12 I QUATTRO CONCETTI DI BASE IN CROMATOGRAFIA K = (Rt analita - Rt non trattenuto ) Rt non trattenuto Volume morto: Il tempo o volume di eluizione di un composto che è non trattenuto, cioè che non interagisce affatto con la fase stazionaria

13 I QUATTRO CONCETTI DI BASE IN CROMATOGRAFIA α : Selettività α = k 2 k 1 Selettività: rapporto dei fattori di capacità di due picchi eluenti La selettività misura le differenze di interazione tra i composti e la fase stazionaria

14 I QUATTRO CONCETTI DI BASE IN CROMATOGRAFIA N : efficienza del sistema (piatti teorici) Efficienza: misura l affilatezza del picco eluente dalla colonna. E espressa come il numero di piatti teorici della colonna. Il numero di piatti teorici si calcola come il rapporto tra il tempo di ritenzione dell analita diviso per l ampiezza del picco a metà altezza, tutto al quadrato e moltiplicato per 5,54.

15 I QUATTRO CONCETTI DI BASE IN CROMATOGRAFIA R : risoluzione Misura la bontà della separazione tra due picchi eluenti. R = (t R(B) t R(A) ) 0,5 (W b(a) + W b(b) ) E calcolata come la differenza tra i tempi di ritenzione di due picchi divisa per l ampiezza media dei due picchi alla linea di base

16 I QUATTRO CONCETTI DI BASE IN CROMATOGRAFIA ASIMMETRIA DEL PICCO La forma del picco è un indicatore importante delle prestazioni cromatografiche. A= b/a Dove a e b sono le distanze della curva dalla verticale tracciata nel punto massimo del picco, misurate in corrispondenza del 10% dell altezza del picco, rispettivamente a destra e a sinistra del punto massimo.

17 I QUATTRO CONCETTI DI BASE IN CROMATOGRAFIA Dipendenza della Risoluzione da Fattore di capacità, Selettività ed Efficienza Efficienza: La larghezza del picco è funzione dell efficienza. Maggiore è l efficienza, più stretti risultano i picchi e, perciò, migliore è la risoluzione Selettività: La differenza in ritenzione tra due composti è funzione della selettività. Maggiore è la differenza delle interazioni dei due composti con la fase stazionaria, maggiore la selettività e maggiore la risoluzione Fattore di capacità: Dato che la risoluzione dipende dalla selettività e che questa non è altro che il rapporto dei fattori di capacità, allora la risoluzione è anche funzione dei fattori di capacità.

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19 INTERAZIONI SOLUTO-FASI Le interazioni interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e le due fasi (mobile e stazionaria) sono deboli: se così non fosse non ci sarebbe eluizione. Sono sfruttate a scopo separativo le seguenti interazioni interazioni: legami a idrogeno interazioni dipolo-dipolo interazioni dipolo-dipolo indotto Forze di Van der Waals Interazioni steriche In tutte queste interazioni svolge un ruolo solitamente decisivo la polarità delle due fasi. Spesso possono essere presenti più tipi di interazione nello stesso processo cromatografico

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22 Alcuni materiali possono fungere da adsorbenti di analiti come ad esempio la silice (gruppi Si-OH). Per l eluizione viene scelto un eluente con polarità più vicina all analita più polare presente nella miscela (es.alcol come eluente di analiti che contengono gruppi ossidrilici) Idrossiapatite (Ca5(PO4)3OH Utilizzata per separare DNA a singolo filamento dal doppio filamento. A basse concentrazioni di tampone fosfato si legano entrambe le specie; aumentando la concentrazione di tampone viene desorbito selettivamente il DNA a singolo filamento, aumentando ancora la concentrazione del tampone viene rilasciato il DNA a doppio filamento) Interazione idrofobica: sfrutta l idrofobicità superficiale delle proteine per l interazione con gruppi alchilici (esile,ottile) o fenolici legati alla matrice. Tale cromatografia viene utilizzata dopo il salting out con solfato d ammonio per facilitare l esposizione delle regioni superficiali idrofobiche delle proteine e consentire l adsorbimento alla fase stazionaria. L eluizione dalla fase stazionaria avviene utilizzando forza ionica gradualmente minore, o utilizzando un competitore che ha un affinità maggiore della proteina per la fase stazionaria

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27 1 - Il miscuglio da separare è sciolto in un opportuno solvente (fase mobile) e stratificato sopra la fase stazionaria 2 - La fase mobile è aggiunta dall'alto all'interno della colonna 3 - I componenti della miscela vengono trascinati dalla fase mobile con velocità diverse e quindi iniziano a separarsi 4 - Ogni componente del miscuglio è raccolto separatamente. Prima verranno raccolti i componenti adsobiti dalla fase fissa più debolmente e poi via via gli altri. Cromatografia su colonna Nella cromatografia su colonna, la fase stazionaria, in genere associata a una matrice inerte e insolubile, è contenuta in una colonna di vetro, plastica o metallo. La fase mobile passa attraverso quella stazionaria in seguito alla pressione generata per gravità dal dislivello del liquido o a quella generata da un piccolo compressore. Le colonne correntemente in uso sono corredate di valvole, rubinetti, sistemi di collegamento che ne facilitano l utilizzo. La tecnica è utilizzata sia per scopi analitici che preparativi. In genere si procede nel seguente modo:

28 Cromatografia L efficacia della separazione mediante colonna cromatografica dipende dalla corretta scelta del sistema cromatografico: fase mobile, quantità e tipo di fase stazionaria, dimensioni della colonna. Un metodo ben consolidato per acquisire tutte le informazioni per condurre una cromatografia su colonna efficace è la TLC. Condizione indispensabile è però che il tipo di assorbente sulla TLC e nella colonna siano identici. Vi sono varie ragioni per scegliere la TLC come tecnica per le analisi preliminari. Infatti: La TLC è rapida: vari solventi possono essere provati simultaneamente per scegliere la migliore fase mobile. La TLC è facile da fare. La TLC è economica: impiega pochissima sostanza e pochissimo tempo. La TLC permette di identificare le sostanze per assorbimento UV (usando lastre con indicatore di fluorescenza) o utilizzando reattivi di rivelazione. Nella cromatografia su strato sottile (TLC), la fase stazionaria è contenuta in un sottile strato di matrice solida, stratificata su una lastra di vetro, plastica o alluminio. La fase mobile passa attraverso quella stazionaria per capillarità in senso verticale.

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31 Fase stazionaria La silice, con varie porosità e dimensioni delle particelle, è l adsorbente più ampiamente usato; in alcuni casi si usano gel di alluminio o poliamidi. Il gel di silice consiste in atomi di silicio e di ossigeno a formare reti tridimensionali. Gruppi silossanici Gruppi silanolici Pori nella fase stazionaria Le dimensioni delle particelle, la forma, la densità e la resistenza alla compressibilità hanno un ruolo prominente nella permeabilità del letto, nella stabilità e nell efficienza della colonna. Più piccola è la particella adsorbente, migliore è la separazione, ma anche maggiore la resistenza al flusso e il tempo necessario per effettuare una completa separazione. Su scala da laboratorio, sono raccomandate dimensioni delle particelle di μm, μm o μm, che forniscono buona efficienza di separazione e resistenza al flusso (contro-pressione) non troppo alta.

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34 Fase mobile La fase mobile è il paramentro più facilmente variato quando si ottimizza un sistema cromatografico. Un eluente ideale deve: solubilizzare completamente il campione; essere trasparente all UV alla lunghezza d onda utilizzata dal rivelatore; se consiste di una miscela di solventi, si richiede che tali solventi siano miscibili; avere un basso punto di ebollizione, che assicura una procedura di recupero facile, non aggressiva ed economica. Comunque, i solventi usati non dovrebbero avere un punto di ebollizione troppo basso (Tb< 40 C), altrimenti potrebbero evaporare già durante la separazione; avere bassa viscosità per minimizzare i problemi di contropressione della colonna; avere stabilità e inerzia chimica in maniera da evitare la contaminazione o modificazione del campione; avere bassa tossicità; Avere bassa infiammabilità; Avere basso costo.

35 Fase mobile: Serie eluotropica per il gel di silice La forza del solvente è la proprietà di spostare una sostanza dai siti attivi della fase stazionaria. Nel caso di un alcano, per esempio, questa proprietà è molto debole, mentre nel caso del metanolo è molto pronunciata. Se i solventi vengono ordinati in ordine crescente di forza, si ottiene quella che viene chiamata una serie eluotropica. Frequentemente, un esperimento preliminare condotto per cromatografia su strato sottile fornisce informazioni utili nella scelta della fase mobile.

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41 Esempio di buona separazione cromatografica

42 Cromatografia Flash Granulometria della fase: Dimensioni delle particelle ( es mm) Intervalli di mesh ovvero numero di fori per pollice lineare (2.54 cm) di un setaccio che trattiene ovvero lascia passare completamente i granuli della fase. ( es mesh) Rapporto in peso fase stazionaria/miscela da 1:20-50 fino a 1: per separazioni difficili Diam (mm) Vol Campione (mg) el. (ml) R f >0.2 R f > Vol.fr (ml) Tecnica introdotta da Still nel 1978 W. C. Still, M. Kahn and A. Mitra, J. Org. Chem. 1978, 43, 2923.

43 Abbinare i composti alle macchie su TLC Eluente 90/10 Esano/Acetato di Etile 1 HO O H 3 C O H O H CH 2 2 Cl O CH 3 3 A B C D 4 Soluzione: 1=D, 2=B, 3=C, 4=A

44 Quale miscela di eluenti è meglio utilizzare? Eluente: esano (A) / Acetato di Etile (B) 75/25 90/10 95/5 98/ Dipende dal prodotto che ci interessa isolare: La miscela 95/5 è da preferire se vogliamo isolare il composto 1 o 2 La miscela 90/10 permette di separare i composti 3 e 4 La miscela 75/25 va bene per recuperare il composto 5

45 RICAPITOLANDO Tecnica Stato di aggregazione Proprietà chimicofisica Distillazione Liquido Punto di ebollizione Cristallizzazione Solido Solubilità Estrazione con solventi Liquido/Solido Ripartizione tra fasi Cromatografia Liquido/Solido Ripartizione tra fasi