CHIMICA BIOLOGICA. Seconda Università degli Studi di Napoli. DiSTABiF. Corso di Laurea in Scienze Biologiche. Insegnamento di. Anno Accademico

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1 Seconda Università degli Studi di Napoli DiSTABiF Corso di Laurea in Scienze Biologiche Insegnamento di CHIMICA BIOLOGICA Prof. Antimo Di Maro Anno Accademico Lezione 11

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3 fattore trasformante

4 L'esperimento di Avery dei suoi colleghi MacLeod e McCarty risale al 1943 e rappresenta una delle esperienze fondamentali per l'avanzamento delle conoscenze nel campo della genetica e della biologia molecolare. separo inietto

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6 Gli acidi nucleici

7 Acidi nucleici Acido ribonucleico Ribosio Quattro basi azotate (A, U, G e C) il gruppo fosfato Acido desossiribonucleico Nel ribosio un idrogeno sostituisce l ossidrile in 2 Quattro basi azotate (A, T, G e C) il gruppo fosfato

8 Organizzazione gerarchica Anche per gli acidi nucleidi si parla di struttura primaria (sequenza) struttura secondaria (doppia elica ) e struttura terziaria (arrangiamento nello spazio)

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10 Ribosio

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12 Gli zuccheri presenti negli acidi nucleici sono 2-deossi-D-ribosio (DNA) e D-ribosio (RNA)

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14 Tautomerizzazione delle Basi

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19 Nucleosidi Il legame tra basi eterocicliche e ribosio forma i diversi Nucleosidi Il legame è di tipo N-β-glicosidico tra il Carbonio anomerico C1 dello zucchero e l N9 delle purine o l N1 delle pirimidine Il legame può avere due orientazioni: Syn e Anti. Anti è predominante Hanno numerosi gruppi polari e sono solubili in acqua. Sono facilmente idrolizzabili da soluzione acquose di acidi. syn anti

20 Nucleosidi Base Zucchero Nucleoside DNA Adenina 2-deossi-D-R. 2 -deossiadenosina Guanina 2-deossi-D-R. 2 -deossiguanosina Citosina 2-deossi-D-R 2 -deossicitidina Timina 2-deossi-D-R. 2 -deossitimidina RNA Adenina D-R. Adenosina Guanina D-R. Guanosina Citosina D-R. Citidina Uracile D-R. Uridina

21 Nucleotidi I nucleotidi sono ESTERI FOSFATO dei nucleosidi. Il sito di fosforilazione è l ossidrile al 5 dello zucchero Possono essere mono- di- e tri-fosfati (Es.: TMP, TDP, TTP.) I di- e tri-fosfati sono legati da legame anidridico, stabile e ad alta energia

22 + circa 30 kjoule/mol (oppure 7,3 kcal/mol) Da kcalorie a kjoule si passa moltiplicando per 4,1868

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25 + circa 30 kjoule/mol (oppure 7,3 kcal/mol) Da kcalorie a kjoule si passa moltiplicando per 4,1868

26 + circa 30 kjoule/mol (oppure 7,3 kcal/mol) Da kcalorie a kjoule si passa moltiplicando per 4,1868

27 Funzioni dei nucleotidi Unità strutturali degli acidi nucleici Deposito di energia delle reazioni di trasferimento di fosfato (ATP - GTP) Mediatore di processi cellulari (camp) Parte di coenzimi (NADH, FAD, CoA ) Intermedi di reazioni sintetiche (S-Adenosilmetionina)

28 ATP-ADP-AMP L'adenosina è presente come fosfato in varie forme. Il 5'-monofosfato, difosfato e trifosfato, così come il monofosfato 3',5'-ciclico, sono intermedi chiave in numerosi processi biologici. L'ATP contiene due legami di anidride fosforica ed ha la caratteristica di liberare quantità notevoli di energia quando si idrolizza ad ADP e, successivamente, ad AMP. Sono queste le reazioni che forniscono l'energia necessaria per altre reazioni biologiche. circa 30 kjoule/mol (oppure 7,3 kcal/mol) Da kcalorie a kjoule si passa moltiplicando per 4,1868

29 Derivati dell AMP Il più comune è 3'-5'- adenosina monofosfato ciclico, camp, prodotto dall enzima adenilato ciclasi È un secondo messaggero per la trasduzione del segnale dalla superficie cellulare all interno della cellula. E usato dalla protein-chinasi camp dipendente (PKA) per fosforilare molte proteine. La forma ciclica di GMP (cgmp), è un secondo messaggero analogo a camp, ma con funzioni distinte

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32 S-adenosilmetionina La S-adenosil metionina è una forma attivata di metionina per la donazione di metilici

33 CoA, NAD +, FAD Coenzimi importanti contengono nucleotidi nella loro struttura: Coenzima A, nella cui struttura è presente l'adp, un agente biologico capace di trasferire i gruppi acilici, che ha un ruolo chiave nel metabolismo dei grassi. Il nicotinammide adenina dinucleotide (NAD) ed il flavina adenina dinucleotide (FAD) sono coenzimi che partecipano a numerose reazioni biologiche di ossidoriduzione.

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37 Polinucleotidi I polinucleotidi si formano dalla condensazione di due o più nucleotidi tra il fosfato legato al 5 -OH del ribosio di un nucleotide ed il 3 -OH del ribosio dell altro con eliminazione di H 2 O Ogni fosfato ha ancora un protone acido che, a ph 7, è ionizzato (carica negativa sull'ossigeno). Se il gruppo fosfato fosse indissociato, la sostanza sarebbe un acido; polinucleotidi biologici = acidi nucleici. Il legame fosfodiesterico è direzionale, e la sequenza va da 5 3 La sequenza delle basi definisce la molecola 5 -pgpaptpc-3 I polinucleotidi biologici sono l ACIDO DEOSSIRIBONUCLEICO (DNA) l ACIDO RIBONUCLEICO (RNA)

38 Abbiamo visto i monomeri degli acidi nucleici (PM circa 300/350 dalton) e le differenze chimiche tra DNA e RNA a adesso dobbiamo vedere come si legano tra di loro per ottenere i polideossiribonucleotidi e i poliribonucleotidi

39 Legame fosfodiesterico H H H H

40 Legame fosfodiesterico

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45 Definiti i monomeri, e la loro struttura, e il legame che ne permette la polimerizzazione, come le proteine anche gli acidi nucleici hanno: Struttura primaria: la successione delle basi (singolo filamento) Struttura secondaria: a doppio filamento Struttura terziaria: conformazione nello spazio

46 La struttura primaria degli acidi nucleici

47 Struttura primaria: la successione delle basi (singolo filamento)

48 Basi rare.. bassa frequenza

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50 La struttura secondaria del DNA

51 Regole di Chargaff: Nel DNA la quantità di adenina (A) è sempre uguale alla quantità di timina (T) e la quantità di citosina (C) è sempre uguale alla quantità di guanina (G). Di conseguenza il quantitativo di basi puriniche (A+G) è sempre uguale al quantitativo di basi pirimidiniche (C+T). A =1 T G = 1 C G = 1 C+5 me-cit

52 Foto 51 Rosalind Franklin 1. è un elica 2. probabilmente una doppia elica antiparallela 3. i fosfati sono presenti all esterno

53 1953. Watson e Crick propongono il modello a doppia elica del DNA

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56 Franklin Wilkins 89

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59 Struttura secondaria del DNA, modello Watson-Crick Elica destrorsa costituita da due catene polinucleotidiche antiparallele Le basi sono all interno dell elica allineate ad angolo retto con l asse dell elica (deossiribosio e fosfato all esterno) Le due catene sono unite da ponti idrogeno tra purine di una catena e pirimidine dell altra G-C formano 3 legami idrogeno A-T formano 2 legami idrogeno Le eliche sono a polarità invertita ma complementari!

60 3,4 Ǻ 34 Ǻ un giro completo, circa 10,5 basi Il diametro è di 20 Ǻ

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62 Le cariche dei fosfati sono stabilizzate o da ioni (Mg 2+ ) o da interazione con proteine basiche

63 La struttura secondaria degli acidi nucleici è stabilizzata solo dai legami ad idrogeno tra le basi?? No Vi sono anche le interazioni idrofobiche tra le coppie di basi sovrapposte (impilate) sono la forza trainante che stabilizza la struttura secondaria del DNA e degli acidi nucleici con struttura secondaria

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65 Conformazioni del DNA Il modello della doppia elica di Watson-Crick è in realtà una semplificazione. Le conformazioni ad elica del DNA vengono attualmente classificate in tre famiglie generali: forme A, B e Z. B A Z

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67 B-DNA Forma predominante = regolare elica destrorsa di Watson e Crick, con basi perpendicolari all asse dell elica Si ottiene quando il DNA è completamente idratato (in vivo) Diametro: circa 20 Ǻ 10 basi per giro completo dell elica (10,5) 3,4 Ǻ = distanza tra due basi (3,4 Ǻ) 34 Ǻ = per ogni giro d elica In soluzione 36 = angolo rotazione tra due basi direzione di rotazione dell elica destrorsa La superficie esterna mostra due solchi separati dalla catena fosfato-deoribosio: solco (scanalatura) maggiore (major groove) e solco minore (minor groove).

68 Minor groove Solco maggiore Major groove Solco minore

69 A-DNA Ottenuto in condizioni di disidratazione non fisiologica (sembra non esistere in vivo) Elica destrorsa con catene antiparallele Diametro circa 26 Ǻ 11 coppie di basi per giro completo dell elica 33,1 rotazione angolare tra due basi adiacenti 2,6 Ǻ = distanza tra due basi adiacenti

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71 Z-DNA Struttura trovata in sequenze caratterizzate da alternanza di G e C. Citosine metilate (isole metilate ricche in CG) Probabile presente anche in vivo Elica sinistrorsa e la dorsale zucchero-fosfato segue un andamento a zig-zag. Guanidine (purine) in posizione sin. Major groove molto superficiale e minor molto stretto. sin anti

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77 Aspetti chimico-fisici degli acidi nucleici

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79 1.0 Assorbanza a 260 nm 0.5 A= lc nm 260nm 300 nm

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81 Denaturazione al calore

82 Denaturazione termica del DNA - Ipercromismo - Ipocromismo -Tm

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85 Idrolisi alcalina dell RNA (in ambiente basico) RNAsi, enzimi che degradano il DNA

86 E. coli

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91 Struttura terziaria

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94 Topoisomerasi di tipo I e di tipo II ed enzimi che ne regolano gli avvolgimenti Topoisomerasi di tipo I tagliano una sola elica Topoisomerasi di tipo II tagliano due eliche contemporaneamente

95 Girasi Topoisomerasi di tipo II

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98 Nucleosoma H2A H2B H3 H4 (x 2, ottamero) Che caratteristiche hanno gli istonici del nucleosoma

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100 circa 150 deossin circa 60 deossin

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106 cariotipo di quale specie?

107 Oltre alle differenze chimiche che c è da sapere sul RNA?

108 RNA, classi

109 trna L RNA generalmente si dice che è a singolo filamento, ma in realtà può avere una struttura primaria, secondaria (A=U, e G=C), e terziaria Struttura secondaria

110 Legame in posizione 5 della pirimidina Diidrouridina Ribosio

111 Braccio accettore trna A C Base C Purinica 5 3 OH Struttura tipo DNA A Per l ossidrile del Ribosio in 2 Ansa D diidrouridina Ansa T ΨC Struttura terziaria Ansa dell anticodone

112 rrna RNA ribosomale 16S, struttura secondaria

113 mrna Tipo DNA A nella zona dell ibrido

114 mrna Splicing hnrna RNA eterogeneo nucleare

115 Strutture palindromiche negli acidi nucleici, sia DNA che RNA. Sono importanti perché rappresentano spesso zone di interazione con fattori di regolazione Palindromo Le-ta-le, Ne-ro-ne, Radar, Anilina

116 Palindromo Una sequenza palindromica è una regione della struttura primaria del DNA costituita da due successioni di basi ripetute ed invertite (in figura). Struttura a forcina Sono sequenze autocomplementari lungo una catena e pertanto sono in grado dare appaiamenti intracatena formando strutture a forcina. Struttura a croce -Se sono coinvolte due catene

117 Assodato che l RNA si polimerizza utilizzando come stampo il DNA, come si replica il DNA. In modo conservativo, dispersivo o semiconservativo?

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119 L'esperimento di Meselson e Stahl del 1958

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121 Replicazione semiconservativa