Le Emoglobinopatie e metodi diagnostici. Prof. Fabiana Passaro

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1 Le Emoglobinopatie e metodi diagnostici Prof. Fabiana Passaro

2 Difetti di produzione di emoglobina su base ereditaria: - le TALASSEMIE, difetti quantitativi di produzione dell emoglobina a carico delle catene α o β. - le EMOGLOBINOPATIE, disordini qualitativi della produzione dell emoglobina. Considerate nel loro insieme, rappresentano le malattie monogeniche più comuni nella razza umana. Ne è portatore il 7% circa della popolazione globale e affetto il 2,7% dei nuovi nati.

3 Originariamente endemici del Sud Europa, dell'africa, del Medio Oriente e dell'asia, sull'onda dei flussi migratori si sono ormai diffusi in tutto il mondo.

4 L emoglobina è un complesso di quattro catene polipeptidiche (globine), ognuna delle quali contiene un gruppo eme (complesso ferro-porfinina) che le conferisce il colore. Nell adulto, il componente principale dell emoglobina è l HbA, costituita da 2 catene polipeptidiche α e 2 catene polipeptidiche ß. La frazione principale dell HbA (ααßß) viene definita HbA0.

5 TIPI DI EMOGLOBINA NELL ADULTO NORMALE

6 α2γ2 Durante la vita fetale vengono prodotte le catene gamma, per cui avremo l emoglobina fetale (HbF) con la formula α2γ2. Dopo poco tempo comincia la produzione delle catene beta e si forma l emoglobina A (HbA, con formula α2β2); alla nascita coesistono entrambe le emoglobine: 60% HbF e 40% HbA. L HbF è più adatta al trasporto dell ossigeno dalla placenta al feto, l HbA è più adatta per il trasporto dell ossigeno dai polmoni agli organi periferici, per cui alla nascita l HbF comincia a essere sostituita dall HbA (dall HbF degratata origina la bilirubina che può causare ittero alla nascita). Una parte dell emoglobina adulta (2,5% circa) contiene due catene delta invece delle catene beta: è chiamata HbA2 (formula α2δ2).

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10 MECCANISMI MOLECOLARI CHE PRODUCONO LE TALASSEMIE 1. Delezione genica (per lo più Tal) Mutazione della regione promoter 3. Anomalie dello splicing 4. Mutazione del segnale di poliadenilazione 5. Interruzione prematura (Mutazione non senso e frameshift) 6. Emoglobine instabili

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12 α TALASSEMIE Normale αα/αα Portatore silente (α 2 talassemia) -α/αα Portatore (α 1 talassemia) --/αα Portatore (α 1 talassemia) -α/-α Malattia da emoglobina H --/α- Idrope fetale --/--

13 TALASSEMIE Diffuse prevalentemente nel Sud-Est asiatico Quadri clinico-ematologici variabili a seconda del grado di riduzione nella produzione delle catene Se mancano 2 geni : quadro clinico sovrapponibile a talassemia minor. Se mancano 3 geni : malattia da HbH ( 4 ). Severa anemia ipocromica, microcitica, con componente emolitica, splenomegalia. Se mancano 4 geni : idrope fetale (80% Hb Bart): incompatibile con la vita

14 β TALASSEMIE

15 STATI CLINICO-EMATOLOGICI DELLA TALASSEMIA PORTATORE ASINTOMATICO - TALASSEMIA MINOR o MINIMA (MICROCITEMIA) TALASSEMIA INTERMEDIA TALASSEMIA MAIOR (MORBO DI COOLEY)

16 Il gene malato, indicato come β0, quando è presente in unica copia (eterozigote: β0/β) determina una lieve anemia, detta Talassemia Minor NORMALE TALASSEMIA MINOR-MINIMA Hb g/dl Eritrociti x 10 6 / L HCT (%) MCV ( 3 ) Elettroforesi Hb Hb A 2 < 3% Hb A 2 3%

17 Se il gene è trasmesso da entrambi i genitori e quindi si presenta in duplice copia (omozigote: β0/β0), la malattia si manifesta nella forma più grave: Talassemia Major (o Morbo di Cooley), che porta spesso a morte il bambino nella seconda infanzia. Esistono una serie di varianti intermedie (talassemia intermedia, talassemia delta-beta, Hb Lepore ecc.), legate alla presenza di mutazioni del gene (indicato con β+) che portano a riduzione e non a mancata sintesi delle catene beta. GENOTIPO HB Omozigosi tal 0 Omozigosi tal + Omozigosi -tal 0 FENOTIPO HB Prevalenza HbF HbA 2 aumentata HbA assente Prevalenza HbF HbA 2 aumentata HbA presente Solo HbF Omozigosi Hb Lepore Doppia eterozigosi per i difetti su elencati HbF + Hb Lepore Variabile (sempre prevalente HbF)

18 δβ-talassemie e Hb Lepore Difetti caratterizzati dalla delezione del gene δ e β sullo stesso cromosoma. Una forma particolare è detta Lepore: due catene α normali e due catene non α, costituite dai primi residui amminoacidici della catena δ e dagli ultimi della catena β. L Hb Lepore, pertanto è il prodotto di un gene δβ da fusione, dovuto ad un processo di «crossing over ineguale». Questo gene ha una ridotta attività trascrizionale e quindi rientra tra i difetti talassemici.

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20 Le emoglobinopatie sono malattie caratterizzate da anomalie qualitative dell emoglobina geneticamente determinate, legate a mutazioni puntiformi di uno dei geni che codificano le catene proteiche che formano l emoglobina. Il difetto genetico comporta la perdita o la sostituzione di un singolo amminoacido di una catena globinica, in grado di modificare la forma tridimensionale della molecola e alterarne la funzione. Esistono almeno 200 diverse emoglobine anomale. VARIANTE MUTAZIONE HbS α 2 β (6 Glu Val) 2 HbC α 2 β 2 (6 Glu Lys) HbD-Los Angeles o Punjab α 2 β 2 (121 Glu Gln) HbO-Arab HbE α 2 β 2 (121 Glu Lys) α 2 β 2 (26 Glu Lys)

21 L HbS è responsabile dell anemia falciforme, una forma di anemia emolitica, caratterizzata dalla presenza di globuli rossi a forma di falce (la S di HbS deriva da sickle, che in inglese signifi ca falce). Una mutazione di un singolo amminoacido nella catena beta (una valina al posto dell acido glutammico in posizione 6 N-terminale) rende l emoglobina instabile, perché allo stato ridotto (non ossigenato) tende a formare cristalli liquidi, che deformano il globulo rosso. Questa deformazione a falce è favorita da un ph basso e dalla disidratazione dei globuli rossi. La falcizzazione dei globuli rossi è intensa solo nei soggetti omozigoti, nei quali tutto il sangue contiene HbS. I globuli rossi falcizzati sono rigidi e si bloccano nella microcircolazione, determinando anossia tessutale; inoltre, i globuli rossi falcizzati vivono meno e vengono distrutti dalla milza e dagli altri organi emocateretici, per cui l anemia è emolitica (emolisi = distruzione dei globuli rossi).

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24 ELETTROFORESI SU ACETATO DI CELLULOSA IN CONDIZIONI ALCALINE (ph8.6) L Hb presenta carica netta negativa e migrerà verso il polo positivo. Le differenze dipendono dalle sostituzioni amminoacidiche che modificano la carica

25 Acetato di cellulosa: in commercio sono disponibili strisce sottili e uniformi di acetato di cellulosa ad elevata purezza e dotate di una struttura microporosa e omogenea con le quali si osserva un adsorbimento molto scarso, anche lavorando con macromolecole. Ottimale per la separazione di composti marcati e per l'applicazione di microtecniche, quali l'immunodiffusione e l'immunoelettroforesi, mentre non è adatto a scopi preparativi. Questo supporto ha trovato applicazione in chimica clinica per la separazione delle proteine ematiche, delle glicoproteine, delle lipoproteine e delle emoglobine.

26 Elettroforesi su Acetato di cellulosa E' una tecnica molto impiegata nella separazione delle proteine del siero. Il siero costituisce la parte liquida del sangue, privato delle cellule e del fibrinogeno. Le proteine del siero sono molte e danno un tracciato elettroforetico tipico in quanto si dispongono in zone caratteristiche. La modalità dell'elettroforesi zonale prevede il mantenimento della proteina in uno stato nativo. Tampone veronal-acetato ph 8.7 Corsa: 200 V per 30 min Fissaggio: TCA 10% Colorazione: Rosso Ponceau o Amido Black 0.5% per min Le proteine separate, vengono evidenziate con opportuna colorazione, quindi la loro composizione percentuale è misurata mediante densitometria

27 Le varie emoglobine vengono eluite in tempi diversi in base alla loro carica netta rispetto ad un gradiente di forza ionica crescente, passando attraverso una colonna a scambio cationico costituita da materiale non poroso (micro biglie brevettate a carica negativa). Nella colonna, le cariche nette delle proteine di emoglobina interagiscono con le cariche negative sulla resina non porosa all interno della colonna. Quando inizia l analisi, viene iniettato sulla colonna l eluente 1, eluente con la forza ionica minore (livelli minimi di ph e di concentrazione dei sali). Questo tampone eluisce le frazioni legate debolmente come la HbF. In una seconda fase, si passa dall eluente 1 all eluente 2 (stesso ph dell eluente 1, ma maggiore concentrazione di sali). Questo eluente eluisce HbA0 e HbA2. Nella terza fase l eluente 2 passa ad un gradiente tra l eluente 1 e l eluente 3 (rapporto 1/1), che ha il ph maggiore e più alcalino e la maggiore concentrazione di sali. Nella quarta fase quest ultimo gradiente passa ad un gradiente con rapporto di ¼ tra l eluente 1 e l eluente 3. Nella quinta ed ultima fase, il gradiente passa al solo eluente 3 per eluire tutte le frazioni che si trovano ancora sulla colonna. Le diverse frazioni eluite dalla colonna passano per il rilevatore prima di essere eliminate. Il rilevamento avviene mediante assorbimento con LED a due lunghezze d onda, con lettura campione a 415nm e lettura di riferimento a 500nm. Cromatografia liquida ad alta prestazione

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29 STEP DIAGNOSTICI Esame Emocromocitometrico: MCH, MCV (MCH-contenuto cellulare medio di emoglobina in picogrammi; MCV- volume cellulare medio in femtolitri) Elettroforesi o HPLC per le diverse componenti Hb Assetto marziale: sideremia, transferrina, ferritina Esame microscopico dello striscio periferico Analisi biomolecolare

30 Step diagnostici MCV > 78 fl MCH > 27 pg Assetto Hb A + A2 < 3.2% Normale

31 Step diagnostici MCV < 78 fl MCH < 27 pg Assetto Hb A + F (0.1 7%) + A2 > 3.2% Portatore di β-talassemia

32 Step diagnostici MCV < 78 fl MCH < 27 pg Assetto Hb A + A2 < 3.2% Assetto Marziale Carenza di Ferro Ferro Normale Portatore di β-talassemia Portatore di δβ-talassemia Portatore di α-talassemia