ISTITUTO ONCOLOGICO VENETO Istituto di ricovero e cura a carattere scientifico. Linea di ricerca. Via Gattamelata, Padova

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1 ISTITUTO ONCOLOGICO VENETO Istituto di ricovero e cura a carattere scientifico Linea di ricerca Via Gattamelata, Padova

2 Linea di ricerca 3 Valutazione del rischio genetico E' noto che la malattia neoplastica è una situazione molto complessa sotto il profilo eziopatogenetico, che non può ovviamente prescindere da un momento genetico; lo studio delle alterazioni di specifici geni nelle neoplasie è quindi un campo di intensa ed avanzata ricerca nell'ambito IOV. E' noto oggi che una piccola quota di neoplasie, pari a circa il 5% del totale, si sviluppa su base eredo-familiare. La ricerca sulle neoplasie eredo-familiari si è per ora concentrata attorno a tre principali temi: le neoplasie eredo-familiari della mammella e dell'ovaio, il melanoma eredo-familiare, e il cancro del colon-retto familiare non poliposico. Per quanto attiene al primo tema, dopo la scoperta che mutazioni diverse a carico dei geni BRCA-1 e BRCA-2 si associano a un elevato rischio di sviluppare carcinoma mammario o ovarico, si è avviata una ricerca volta, sul piano conoscitivo, ad approfondire i meccanismi che dall'alterazione genetica portano alla perdita del prodotto genico e quindi alle conseguenze dell'assenza delle proteine BRCA sulla fisiologia cellulare; sul piano traslazionale, a definire la prevalenza del fenomeno nella popolazione veneta, fornendo ai nuclei familiari affetti una consulenza genetica e la conseguente caratterizzazione della mutazione. Sono state sottoposte a screening oltre 300 famiglie del comprensorio veneto con sospetta eredo-familiarità per carcinoma della mammella/ovaio, che soddisfano i rigidi criteri per l'inclusione del nucleo familiare nella casistica (più casi di neoplasia mammaria o ovarica in consanguinei dello stesso ramo parentale, spesso insorgenti in giovane età e bilaterali o multiple); lo studio viene condotto nell'ambito di una cooperazione multicentrica con altri 8 centri italiani, all'interno di un network europeo sull'argomento. Per quanto attiene al melanoma eredo-familiare, solo più di recente sono stati individuati alcuni geni, tra cui soprattutto CDKN2a, la cui alterazione può associarsi in maniera causale allo sviluppo di melanomi cutanei in un certo nucleo familiare. In questo settore, le ricerche iniziate prevedono l'implementazione del reclutamento di nuclei familiari con sospetta eredo-familiarità per melanoma, sulla base di una rete cooperativa estesa alla Regione del Veneto; attualmente, sono state arruolate oltre 60 famiglie che rispondono alle caratteristiche di pedigree. La sindrome nota come carcinoma colo-rettale familiare non poliposico (HNPCC) si trasmette come carattere autosomico dominante ed è caratterizzata da alterazioni a carico di geni del riparo del DNA. La ricerca di mutazioni a carico di tali geni (che sono un numero elevato e non tutti completamente caratterizzati) è un approccio lungo e costoso, per cui si rende necessaria la ricerca di strategie alternative per lo studio di tale condizione. Presso le strutture IOV è da tempo operante un centro per la raccolta della casistica clinica e per lo screening mediante valutazione dell'instabilità dei microsatelliti dei pazienti. Tale test si accompagna, in caso di esito positivo, ad un approfondimento dell'assetto dei geni preposti al riparo del DNA, mediante procedure di sequenziamento. La ricerca ha anche affrontato lo studio della prevalenza di alterazioni dei microsatelliti nel carcinoma colo-rettale sporadico, riscontrando instabilità dei microsatelliti in una percentuale non indifferente di casi (circa il 15%) e mutazioni a carico dei geni del riparo nel 2% circa dei casi esaminati. Di recente si è aggregato allo IOV un nucleo di ricerca che si dedica allo studio delle alterazioni genetiche in sindromi neoplastiche di tipo neuro-endocrino. E' intenzione di tutti i Ricercatori che operano nel campo dell'eredo-familiarità dei tumori di convergere in un'unica Unità Operativa, condividendo così appieno facilities, piattaforme tecnologiche e know-how. 1 - IDENTIFICAZIONE DI NUOVI DETERMINANTI GENETICI NEL TUMORE MAMMARIO E/O OVARICO DI TIPO EREDITARIO Responsabile: Montagna Marco Parole chiave: tumori eredo-familiari, mammella, ovaio, mutazioni, geni

3 Uno dei fattori di rischio più importanti per lo sviluppo del carcinoma della mammella è rappresentato dalla familiarità per lo stesso tipo di tumore e/o per il carcinoma dell'ovaio. L'alterazione costitutiva dei geni BRCA1 o BRCA2 è responsabile di una parte di queste neoplasie. L'identificazione degli individui geneticamente predisposti costituisce un obiettivo di primaria importanza per l'adozione di misure profilattiche finalizzate alla riduzione del rischio di malattia e/o alla diagnosi precoce. Sfortunatamente, l'analisi mutazionale dei geni BRCA1 e BRCA2 risulta spesso non informativa, limitando i benefici del test molecolare ad un ristretto numero di famiglie. Una prima linea di ricerca sarà dedicata a nuovi approcci molecolari in grado di evidenziare alterazioni genomiche di ampie dimensioni che sfuggono ai metodi correntemente utilizzati per l'analisi di mutazioni puntiformi. Lo studio di un ampio campione di pazienti affetti da carcinoma mammario e/o ovarico ereditario, reclutati da differenti Centri italiani, permetterà di stimare la prevalenza di questo tipo di alterazioni nelle famiglie italiane. La caratterizzazione molecolare dei riarrangiamenti genomici porterà inoltre all'identificazione dei meccanismi alla base di questo tipo di alterazioni, fornendo uno strumento indispensabile per la messa a punto di nuove strategie di analisi mutazionale sempre più sensibili e complete. In collaborazione con 4 centri di riferimento nazionale per lo studio dei tumori ereditari della mammella/ovaio sono stati finora raccolti circa 700 probandi risultati eleggibili allo studio. Dodici nuovi pazienti sono risultati portatori di ampie delezioni o duplicazioni di uno o più esoni del gene BRCA1. I riarrangiamenti, identificati tramite la metodica MLPA, sono stati caratterizzati dal punto di vista genomico, funzionale e, nel caso di alterazioni presenti in più famiglie indipendenti, anche tramite l'analisi dell'aplotipo associato alla specifica mutazione. Studi di correlazione genotipo-fenotipo non hanno evidenziato caratteristiche cliniche particolari riconducibili a questo specifico tipo di alterazioni. Ciononostante lo studio permette di stimare che delezioni e duplicazioni del gene BRCA1 interessino circa il 18% (95% CI: 0.12<0.18<0.27) di tutte le famiglie con mutazione del gene, rendendo, di conseguenza, questo tipo di analisi molecolare un requisito essenziale per un processo diagnostico-molecolare dotato di elevata accuratezza e sensibilità. Un secondo approccio verrà dedicato allo studio della rilevanza bio-patologica di varianti di sequenza dei geni BRCA1 e BRCA2 a significato clinico incerto, identificati in circa il 10-15% dei nostri probandi. Parallelamente ad approcci di genetica epidemiologica, linee lifoblastoidi, derivate dai linfociti di probandi affetti e portatori di varianti di sequenza, verranno analizzate in differenti condizioni sperimentali, includendo analisi dei trascritti ed esperimenti di silenziamento genico allele-specifico, al fine di evidenziare in vitro un fenotipo biologico in grado di permettere una definizione del livello di patogenicità della variante in questione. 2 - MELANOMA MALIGNO EREDO-FAMILIARE: ANALISI FUNZIONALE DI VARIANTI GENICHE DI CDKN2A. Responsabile: Menin Chiara Parole chiave: melanoma, tumori eredo-familiari, geni, mutazioni L'oncosopressore CDKN2A/p16INK4A è il principale gene riconosciuto per la suscettibilità al melanoma. La frequenza di mutazioni in questo gene in soggetti con familiarita' per melanoma è di circa 20% ma può variare dal 5% fino al 60% a seconda dei criteri di selezione delle famiglie. Per predire il rischio di sviluppare melanoma nei soggetti portatori di specifiche mutazioni, mutanti CDKN2A devono essere testati funzionalmente con test biochimici e cellulari: a tal fine si valuta la funzionalità delle mutazioni verificando se venga mantenuta la capacità della proteina di inibire la fase G1-S del ciclo cellulare, controllando la capacità di legame alle chinasi 4 e 6 cicline dipendenti (CDK4 e CDK6) ed infine verificando se la forma mutata sia o meno in grado di bloccare la fosforilazione della proteina Rb. Scopo di questo progetto è mettere a punto questi test funzionali per valutare se alcune varianti geniche di CDKN2A con significato patogenetico ancora ignoto, e riscontrate nei probandi appartenenti a famiglie con melanoma, siano da considerarsi mutazioni predisponenti al melanoma. Dagli studi finora eseguiti risulta che p1623asp sia una variante patogenetica del gene

4 CDKN2A e perciò predisponente allo sviluppo del melanoma. Trasfettando una linea cellulare (U2-OS), priva di p16, con un plasmide esprimente la proteina p1623asp mutata, si è constatato che p1623asp non è in grado di legare ed inattivare CDK4, che quindi è in grado di iperfosforilare prb consentendo la progressione del ciclo cellulare. Infatti, le cellule esprimenti p1623asp non mostrano arresto della proliferazione. La mutazione è stata riscontrata anche in un membro della famiglia che non ha sviluppato il melanoma. In studi precedenti è stato dimostrato che le mutazioni hanno penetranza molto variabile in relazione alle diverse aree del pianeta e al loro grado di irraggiamento da UV; tuttavia è stato anche ipotizzato che ogni singola mutazione possa avere un suo grado di penetranza differente dalle altre. E' quindi possibile che, nel nostro caso specifico, la mutazione p1623asp abbia una penetranza inferiore a quella di altre mutazioni e questo giustificherebbe la presenza di un portatore non affetto da melanoma sia nella nostra famiglia che in quelle riportate in letteratura. 3 - MELANOMA MALIGNO EREDO-FAMILIARE: ANALISI GENETICA DEL GENE CDKN2A E IDENTIFICAZIONE DI MODIFICATORI GENETICI DELLA PENETRANZA IN FAMIGLIE AD ALTO RISCHIO ED IN UNO STUDIO A BASE DI POPOLAZIONE. Responsabile: Menin Chiara Parole chiave: melanoma, tumori eredo-familiari, geni, mutazioni, rischio Il melanoma cutaneo maligno è una malattia multifattoriale, in cui sono coinvolti fattori genetici, ambientali e comportamentali dell'ospite. Numerosi studi epidemiologici documentano una stretta associazione tra esposizione solare e rischio di sviluppare melanoma. Inoltre e' stato documentato che nel 10% dei casi esiste una storia familiare positiva, suggerendo l'esistenza di una predisposizione genetica a tale neoplasia. CDKN2A è il principale gene per la suscettibilità al melanoma. Diversi studi hanno valutato il rischio di sviluppare melanoma per i soggetti che portano mutazioni costitutive nel locus CDKN2A analizzando famiglie con più di un caso di melanoma. Uno studio condotto su 80 famiglie provenienti da Europa, Nord America ed Australia ha stimato una penetranza del 67% all'eta' di 80 anni, eccezionalmente elevata per una neoplasia che ha un rischio di circa il 2% nella popolazione generale. Uno studio più recente condotto non su famiglie con casi multipli di melanoma ma sulla popolazione generale ha invece abbassato il rischio di melanoma per i portatori di mutazione del gene CDKN2A al 28% all'eta' di 80 anni: le differenze nella stima di rischio sono dovute ad altri importanti fattori di rischio non ancora identificati, probabilmente più prevalenti in portatori di mutazioni appartenenti a famiglie con casi multipli di melanoma. Esiste quindi una eterogeneità di rischio per melanoma fra i portatori di mutazione di CDKN2A. Scopo di questo studio è contribuire a chiarire i fattori che possono influenzare questo rischio analizzando la presenza di mutazioni costitutive in pazienti con melanoma in uno studio a base di popolazione, valutando tutte le informazioni possibili riguardo eventuali casi multipli di melanoma nella famiglia, caratteristiche cliniche, abitudini comportamentali e tipologie di risposta all'esposizione solare. L individuazione delle famiglie ad alto rischio è stata effettuata seguendo i parametri definiti dal Melanoma Genetics Consortium ed è stato attuato all interno di un Gruppo di Studio Multidisciplinare per il Melanoma, nel quale le diverse unità operative hanno collaborato alle varie fasi del progetto, preventivamente approvato dal comitato etico delle strutture di appartenenza. Fino ad oggi è stato raccolto un campione di sangue da 33 probandi, 10 parenti affetti da melanoma, 3 parenti affetti da un altro tipo di tumore e 2 parenti sani. L analisi mutazionale ha rivelato la presenza di due mutazioni. Una, la Gly101Trp (G101W), è la più comune riscontrata in Italia. È stato riportato che questa mutazione mis-senso provoca un incapacità della p16 di inibire l attività catalitica del complesso ciclina D1-CDK4. L'altra è la Pro48Thr (P48T), che diminuisce la capacità di p16 di inibire la progressione del ciclo cellulare. Un'ulteriore variante, Gly23Asp (G23D), rara e di incerto significato patogenetico, è stata riportata solo un paio di volte in letteratura senza valutazioni funzionali. Diversi studi hanno dimostrato che gli effetti del gene MC1R sulla penetranza di CDKN2A sono in gran parte dovuti alle varianti capelli rossi (RHC). Anche se la nostra

5 casistica è molto ristretta e non permette valutazioni statisticamente significative, si è comunque notato che tutti e tre i pazienti con una mutazione di CDKN2A sono anche portatori di una variante RHC; il paziente portatore della mutazione G101W e affetto da melanoma multiplo è portatore della variante RHC/R151C. L ipotesi avanzata da GenoMEL, che la co-ereditarietà di più di uno di questi polimorfismi nei geni coinvolti possa risultare in una più elevata espressività e penetranza in alcune famiglie, trova conferma anche nella nostra casistica: l 80% delle famiglie con 2 o 3 varianti di MC1R mostra più di 3 casi di melanoma, oppure 2 casi di melanoma e carcinoma del pancreas e/o della mammella. Questo studio sarà esteso anche ai casi di melanoma sporadico che si presentano con caratteristiche sospette per una predisposizione genetica (giovane età di insorgenza o associazione con altri tumori), e che sono ancora in fase di reclutamento. 4 - ASSOCIAZIONE DI VARIANTI GENICHE COSTITUTIVE CON ALTERAZIONI MOLECOLARI DEL TUMORE NELLO SVILUPPO DEL CARCINOMA DEL COLON RETTO. Responsabile: Bertorelle Roberta Parole chiave: geni, colon-retto, tumori eredo-familiari, mutazioni Il carcinoma del colon retto (CRC) è un classico esempio di carcinogenesi multifasica, multifattoriale e multigenica in cui alterazioni a carico di oncogeni e geni oncosoppressori sono i maggiori responsabili dell'iniziazione e della progressione della neoplasia. Recenti studi dimostrano tuttavia che accanto a queste alterazioni molecolari esistono varianti geniche (polimorfismi) in grado di modificare il rischio e/o il fenotipo tumorale. I polimorfismi maggiormente implicati nella suscettibilità al CRC coinvolgono geni che, da un punto di vista biologico-funzionale, risultano i più plausibili. Circa il 50% dei tumori colo-rettali presentano infatti alterazioni a carico del gene oncosoppressore TP53. Varianti genetiche che interferiscano con il pathway mediato da p53 possono essere responsabili della variabilità individuale della manifestazione neoplastica in termini di rischio, di insorgenza precoce o di aggressività della malattia. Obiettivo di questo studio è valutare l'interazione di varianti geniche individuali con alterazioni molecolari del tumore e stabilirne il ruolo relativo nello sviluppo del CRC. In particolare, sarà studiato MDM2-SNP309 e TP53-codon72 in associazione alla presenza di mutazioni e perdita allelica in TP53, K-ras ed instabilità dei microsatelliti. Le analisi finora condotte dimostrano che il polimorfismo sul promotore del gene MDM2 (SNP309) si associa con un'insorgenza precoce del CRC (10 anni prima) nei pazienti senza alterazioni di TP53 nel tumore. Ampliando la casistica ed analizzando 330 pazienti consecutivi affetti da carcinoma colorettale, è stato possibile verificare che l'effetto di SNP309 di MDM2 sull'età di insorgenza del tumore p53 wild-type era legato al sesso dei pazienti: solo nel gruppo delle donne portatrici dell allele G in SNP309 si osservava infatti un'insorgenza anticipata del tumore. Queste osservazioni supportano l ipotesi che gli ormoni femminili possano giocare un ruolo insieme a fattori genetici nello sviluppo precoce del CRC nelle donne. 5 - IDENTIFICAZIONE DELLE FAMIGLIE AD ALTO RISCHIO DI CANCRO DELLA MAMMELLA/OVAIO E DI MELANOMA MALIGNO Responsabile: D'Andrea Emma Parole chiave: tumori eredo-familiari, mammella, ovaio, melanoma, geni, prevenzione Si ritiene che il 5-10% dei tumori in genere insorgano in soggetti predisposti, contraddistinti cioè da un'alterazione genica costitutiva perché ereditata da uno dei due genitori. Scopo di questo progetto è individuare le famiglie ad alto rischio di neoplasia specifica (mammella/ovaio e melanoma maligno) perché presentano più casi in consanguinei dello stesso ramo parentale, spesso insorti in giovane età, e a volte bilaterali o multipli. La consulenza genetica consente quindi di enucleare un gruppo di soggetti sani a rischio da avviare a protocolli di follow-up intensivo per una eventuale diagnosi quanto più precoce possibile. Qualora sia nota l'alterazione predisponente specifica per ciascuna famiglia, è possibile enucleare, a richiesta degli interessati, un ulteriore sottogruppo di soggetti sani geneticamente predisposti allo sviluppo della

6 neoplasia, pur perdurando molti dubbi sui protocolli di follow-up piu' adatti, cioè più o meno aggressivi, per la sorveglianza di questi ultimi individui. 6 - TUMORI GASTROINTESTINALI EREDO-FAMILIARI E VALUTAZIONE DEL RISCHIO INDIVIDUALE PER I TUMORI SPORADICI Responsabile: Nitti Donato Parole chiave: tumori eredo-familiari, colon-retto, rischio, epidemiologia In questo studio viene studiata l'epidemiologia dei tumori ereditari del colon-retto nella Regione del Veneto, con particolare riguardo alla standardizzazione della diagnostica molecolare, del trattamento e del follow-up dei probandi e dei parenti dei probandi. Lo studio porterà ad un aumento della qualità dell'assistenza sanitaria fornita alle famiglie colpite da questa patologia. Inoltre, il confronto del profilo genico di queste neoplasie con quello dei carcinomi colo-rettali sporadici consentirà di formulare nuove ipotesi patogenetiche su questa entità nosologica, aprendo la strada a nuovi approcci diagnostici e terapeutici. 9 - NEOPLASIE FAMILIARI ENDOCRINE: DAI MECCANISMI FISIOPATOLOGICI, ALLA DIAGNOSI MOLECOLARE FINO PREVENZIONE DELLE COMPLICANZE Responsabile: Opocher Giuseppe Parole chiave: tumori eredo-familiari, tumori endocrini, mutazioni, geni L'Unità Operativa di Endocrinologia è un centro di attrazione nazionale per la diagnosi ed il trattamento delle neoplasie endocrine, in particolar modo quelle a partenza dal surrene, dalla tiroide, dall'ipofisi e per quelle ereditarie. Competenze particolari nel campo della medicina traslazionale hanno permesso di sviluppare, con la logica dell'approccio integrato (endocrinologo, biologo molecolare, chirurgo, radiologo ecc.) un percorso clinico-diagnostico dedicato alle neoplasie familiari. Il paziente con neoplasia endocrina familiare è seguito passo a passo, dal sospetto clinico alla diagnosi molecolare, dallo studio della famiglia fino all'organizzazione degli esami di follow-up e alle indicazioni al trattamento chirurgico. Con questo approccio sono attualmente seguiti 15 pazienti con neoplasia endocrina di tipo 1 (MEN 1), 17 pazienti con neoplasia endocrina di tipo 2 (MEN 2), 110 pazienti con malattia di von Hippel Lindau (VHL) e 150 pazienti con feocromocitoma o sindrome feocromocitoma/paraganglioma. Nel corso del 2005 abbiamo analizzato 85 soggetti per mutazioni del gene RET, 28 per il gene MEN 1, 66 per il gene SDHD, 45 per il gene SDHB, 19 per il gene SDHC. Coerentemente con questa organizzazione sono state portate avanti alcune linee di ricerca che si possono così riassumere: MEN 1. Correlazione genotipo-fenotipo nei pazienti con mutazione del gene MEN-1, identificazione dei carriers asintomatici, prevenzione delle complicanze. MEN 2. Analisi di penetranza ed espressività clinica delle mutazioni del gene RET definibili come a rischio medio in alcune famiglie di grandi dimensioni; penetranza ed espressività clinica della mutazione RET V804M; ruolo dei polimorfismi del gene RET nel carcinoma midollare della tiroide apparentemente sporadico. Malattia di von Hippel-Lindau: studio prospettico in un popolazione di grandi dimensioni. Sindrome paraganglioma: prevalenza di mutazioni germinali dei geni SDHB, SDHC, SDHD nei pazienti con paraganglioma apparentemente sporadico; identificazione e caratterizzazione di un effetto fondatore della mutazione SDHD p.y114c, responsabile della sindrome paraganglioma di tipo 1 (PGL-1) in alcune valli contigue del Trentino; predisposizione di uno studio prospettico sulla sindrome PGL-1; analisi del silenziamento genico allele-specifico del gene SDHD sul pathway dell'angiogenesi, HIF 1 alfa, VEGF, prolilidrossilasi III. E' in corso la sistematizzazione della casistica, che prevede una serie di tappe consequenziali: Visita multidisciplinare al paziente con sospetta neoplasia endocrina familiare con medico esperto del settore, genetista, psicologo. Analisi molecolare per la ricerca di mutazioni di piccole o grandi dimensioni a carico dei geni responsabili: RET, MEN-1, VHL, SDHB, SDHD, SDHC. Visita di follow-up da parte di medico esperto del

7 settore. Board review dei casi clinici con indicazioni alla prevenzione delle complicanze. Allestimento di una banca dati e banca di DNA germinale e tumorale.