Reazione a catena della polimerasi (PCR) ed elettroforesi

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1 Gioele Casagranda, Camilla Larentis, Emanuele Pallaoro, Filippo Quattrocchi Povo, 1 marzo 2016 P r o g e t t o C L I L - E s p e r i m e n t o f i n a l e Reazione a catena della polimerasi (PCR) ed elettroforesi Cos è la PCR: introduzione generale e premesse al nostro esperimento La PCR (Polymerase Chain Reaction) è un procedimento che serve per replicare alcune sequenze di materiale genetico al fine di ottenerne molteplici copie che possono essere utilizzate a scopo di ricerca. L'amplificazione mediante PCR consente di ottenere in vitro molto rapidamente la quantità di materiale genetico necessaria per le successive applicazioni. La PCR fu ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il Premio Nobel per la chimica nel Questa metodica ricostruisce in vitro uno specifico passaggio della duplicazione cellulare, ovvero la sintesi della doppia elica di DNA, processo che, come noto, si definisce semiconservativo. Infatti, le doppie eliche che si formano contengono ciascuna un filamento della molecola di DNA originale. Lo stesso discorso vale per la PRC, anche se ad essere duplicato è solo un frammento del codice genetico.

2 La PCR richiede che due molecole d innesco si ibridino alle estremità dei due filamenti opposti della molecola di DNA stampo. Per eseguire una PCR è necessario denaturare lo stampo di DNA e lasciare ai due inneschi, ai nucleotidi e alla DNA polimerasi il tempo di interagire e dare avvio alle reazioni di sintesi. Successivamente il materiale genetico e determinati composti chimici vengono sottoposti a numerosi cicli durante i quali viene riscaldato e raffreddato ripetutamente il mix favorendo denaturazione e duplicazione della molecola interessata. Fino a questo punto si è parlato di DNA, ma per quanto riguarda il nostro esperimento sarebbe più corretto appellare il materiale genetico con il nome di cdna (dall inglese Complementary DNA). Si tratta di una particolare molecola che contiene l informazione genetica e si origina a partire dal singolo filamento di una molecola di mrna per opera dell enzima trascrittasi inversa. La molecola risultante è costituita dal filamento iniziale di mrna e dal filamento duplicato, quindi ha una struttura a doppia elica. La reazione a catena della polimerasi si costituisce di diverse fasi: Denaturazione Consiste nella separazione dei legami a idrogeno che intercorrono fra le basi azotate complementari delle due eliche di cdna.

3 Annealing Si formano dei legami a idrogeno tra i primer e le sequenze di DNA. La temperatura di questo stadio dipende dai primer usati. Durante l annealing vengono utilizzati due primer che si legano ai loro siti specifici. Si formano e si rompono continuamente i legami ionici tra i filamenti dei primer ed i singoli filamenti di DNA che funzionano da template (filamento stampo). I primer che si appaiano esattamente con il filamento stampo formano i legami più stabili e, in questo piccolo tratto di doppia elica, si lega la polimerasi che inizia così a copiare il filamento stampo; Estensione/Elongation La DNA polimerasi estende il filamento a partire dal primer fino alla fine della sequenza. La temperatura di elongation dipende dalla DNA Polimerasi. Durante l estensione la Polimerasi prolunga la sequenza di basi dei primer aggiungendo le basi (complementari al template) dall estremità 5 all estremità 3. Il risultato sono 2 copie di DNA a doppio filamento. Questi step principali vengono poi ripetuti 30 volte attraverso l utilizzo di un termociclatore. Step Temperature Time Initial denaturation 95 C 2 min Denaturation 95 C 15 sec Annealing 58 C 15 sec Extenstion 72 C 15 sec Final Extention 72 C 5 min Hold 4 C Indefinite 30 cicli

4 Nota operativa: Questo esperimento ha un elevata sensibilità ed efficienza; infatti il procedimento, e quindi i risultati, dipendono sensibilmente dalla presenza di materiale genetico contaminante che si può trovare nell ambiente e sulla strumentazione. Il problema della contaminazione è elevato tanto quanto la sensibilità della PCR, questo perché gli elementi contaminanti vengono anch essi amplificati. E quindi opportuno mantenere tutto ciò che può essere necessario al fine dell esperimento il più possibile sterile. Tutti i puntali e le provette Eppendorf sono state sterilizzate attraverso un procedimento a caldo, in autoclave e con onde ultraviolette. Il primo apparato consiste in una camera d acciaio, chiusa ermeticamente al cui interno del vapore sotto pressione produce temperature di 121 C senza che i liquidi vadano in ebollizione. Scopo dell esperimento Eseguire una PCR di cdna derivante da cellule staminali neurali (NSC) ed embrionali (ESC) e verificarne il corretto funzionamento attraverso l osservazione di determinati geni (Nestin, OCT4, 18S) che, come spiegheremo, si esprimono solo ad un determinato grado di specializzazione delle cellule staminali. Strumenti Microprovette Eppendorf;

5 Micropipette con relativi puntali per maneggiare quantità dell ordine di 1-20 microl; Termociclatore (strumento che permette di regolare la temperatura dell ambiente di reazione in maniera precisa e per periodi di tempo ben determinati); Forno a microonde; Vasca di preparazione per gel di Agarosio; Cella elettrolitica per elettroforesi; Pettine per pozzetti; Transilluminatore UV. Materiali Mater mix (23 microl): composto contenente 2.5 microl di buffer di reazione ad una concentrazione 10X, 2.5 microl di MgCl2 50mM, 2.5 microl di dntp 10mM, 1 microl di primer forward 10 microm, 1 microl di primer reverse (i primer nei vari mix sono specifici per determinati geni: Nestin, OCT4 e/o 18S), 10 microm, 0.5 microl di EuroTaq 5U/microL, 14.5 microl di acqua; cdna (2 microl): da cellule NSC per i gruppi 1, 3, 5 e da cellule ESC per i gruppi 2, 4, 6; Agarosio in polvere; TAE buffer 10X; Acqua; Colorante blu;

6 Colorante BIOATLAS UV; Nestin è un gene che è espresso principalmente dalle cellule staminali neurali (e non deve quindi essere presente nelle cellule staminali embrionali). OCT4 è un gene che è espresso principalmente dalle cellule staminali embrionali (e non deve quindi essere presente nelle cellule staminali neurali). 18S è un gene che è espresso in tutte le cellule. Template DNA: filamento stampo di DNA. MgCl2: è un cofattore essenziale per il funzionamento della TAQ. TAQ DNA polimerasi: è un enzima termostabile che aiuta a catalizzare la polimerizzazione dei desossinucleotidi che risultano in un filamento di DNA; proviene dall'organismo termofilo Thermus aquaticus. Primer: è una sequenza a filamento singolo di DNA atta a localizzare la sequenza target. Ne sono necessari due per amplificare un frammento di DNA agganciandosi ai due punti estremi del frammento. dntp: è un mix di nucleotidi desossiribonucleici. PCR buffer: crea un ambiente per l attività ottimale della TAQ.

7 Procedimento Preparare 2 Eppendorf, nelle quali verranno versati, rispettivamente, 23 microl di Master mix + 2 microl di cdna e 23 microl di Master mix + 2 microl di acqua (campione di controllo); in seguito indicarne con una sigla il contenuto. Posizionare nel termociclatore per l esecuzione di 30 cicli di PCR al fine di svolgere la moltiplicazione dei frammenti di DNA secondo lo schema indicato nella premessa. Ogni ciclo si compone, quindi in questo modo: Denaturazione: alla temperatura di 95 C per 15 sec, in seguito ad una denaturazione iniziale che avviene a 95 C per una durata di 2 min. Annealing: alla temperatura di 58 C per 15 sec; Estensione: alla temperatura di 72 C per 15 sec. Si termina con un estensione finale a 72 C per 5 minuti. Poi il composto viene tenuto a una temperatura di 4 C all interno del termociclatore.

8 Preparazione del gel di agarosio L agarosio è un polisaccaride purificato dall agar-agar, una sostanza gelatinosa estratta dalle alghe. E un polimero lineare e neutro, uno zucchero solubile in acqua alla temperatura di ebollizione. Quando raffredda assume la composizione di gel grazie alla formazione di una matrice tridimensionale costituitasi attraverso legami ad idrogeno fra le catene lineari. La sue rete di pori permette al gel di fungere da setaccio e di separare le molecole in base alla loro grandezza e, quindi, anche in base alla loro velocità. Per preparare l ambiente su cui si svolgerà la corsa elettroforetica si diluisce il TAE buffer per crearne una soluzione di questo al 10% volume/volume, quindi si deve aggiungere 1 parte del composto ogni 9 parti di acqua (si intendono partizioni di volume). Il buffer è infatti inizialmente ad una concentrazione che è 10 volte maggiore di quella operativa e va quindi diluito. Per preparare il gel vero e proprio, si prepara una soluzione di concentrazione pari al 2% massa/volume e si mette la soluzione così ottenuta nel forno a

9 microonde. La soluzione viene fatta riscaldare fino a quando, giunta ad ebollizione, diviene trasparente. In seguito la soluzione in questione viene versata nella vasca di preparazione a gelificare, dove in precedenza era stato posizionato il pettino per pozzetti e si aggiungono al composto 9 microl di colorante BIOATLAS che, grazie alla sua proprietà di legarsi con le basi di acido nucleico a doppio filamento ed emettere luce fluorescente se irradiata a raggi UV, ci permette di identificare con precisione i risultati della corsa. Una volta solidificato, si pone il gel nella cella elettrolitica e si ricopre il tutto con la soluzione buffer, fino a che il gel di agarosio non è immerso per 1 cm circa. Elettroforesi su gel di agarosio: A questo punto si devono aggiungere i campioni che hanno subito il processo di PCR nei pozzetti lasciati liberi dalla rimozione del pettine. Abbiamo aggiunto ai

10 nostri campioni un colorante blu che permette di allocare la sostanza nelle fenditure verticali più agevolmente e precisamente e di disciogliere il DNA amplificato in una temporanea fase omogenea più densa dell acqua, che ne evita la risalita dal pozzetto. Le bande centrali contengono un composto detto ladder che essendo costituite da frammenti di lunghezza prefissata (ad esempio, 100, 200, 300, 400 nucleotidi) forniscono per l appunto una scala atta a determinare la lunghezza dei frammenti di DNA che si fanno correre sul gel. La cellula elettrolitica genera un campo elettrico che mette in moto le molecole di DNA aggiunte nei pozzetti. Il DNA è un acido nucleico e liberando protoni assume una carica negativa che fa sì, grazie alla d.d.p. fra i due poli, che venga attratta al polo positivo.

11 Osservazioni e conclusioni Come previsto, si osserva la presenza di Nestin solo nelle cellule neuronali, la presenza dell OCT4 solo in quelle embrionali e il 18S in tutte le cellule. Inoltre dalla tabella e dalle immagini si può notare che tutti i gruppi di controllo hanno dato esito negativo. L ordine seguito TIPO DI BANDE GENE nell introdurre i mix CELLULA OSSERVATE amplificati nei pozzetti NSC SI è lo stesso seguito nella Nestin ESC NO tabella per i campioni Acqua NO contenenti il DNA e inverso per quanto NSC NO riguarda i campioni OCT4 ESC SI contenenti l acqua. Acqua NO Quindi a partire da NSC SI sinistra abbiamo: 18S ESC SI NSC+Nestin, ESC+Nestin, Acqua NO NSC+OCT4, ESC+OCT4, NSC+18S, NSC+18S, ladder, Acqua+18S, Acqua+18S, Acqua+OCT4, Acqua+OCT4, Acqua+Nestin, Acqua+Nestin.

12 La PCR è riuscita alla perfezione. Si sono amplificati tratti di DNA solo nei composti dove ci aspettavamo preventivamente che il processo avesse effetto. Unica nota negativa, forse, una leggera banda nel campione di controllo del gruppo 6 che, come si può notare nella foto al trasilluminatore, ha lasciato una piccola traccia sul gel di agarosio. Bisogna ricordare che il gene 18S è espresso da gran parte delle cellule viventi e quindi anche una leggerissima contaminazione può determinare un esito negativo.