LA REPLICAZIONE DEL DNA E SEMICONSERVATIVA. Esperimenti di Taylor in eucarioti 1957 Esperimento di Meselson e Stahl in procarioti, 1958

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1 LA REPLICAZIONE DEL DNA E SEMICONSERVATIVA Esperimenti di Taylor in eucarioti 1957 Esperimento di Meselson e Stahl in procarioti, 1958

2 Esperimento di Meselson e Stahl, 1958 La replicazione del DNA e semiconservativa

3 Esperimento di Taylor

4 L esperimento di Taylor Prima fase S con timidina triziata; seconda fase S senza Solo uno dei due cromatidi fratelli risulta marcato In questo esperimento vengono evidenziati per la prima volta gli scambi fra cromatidi fratelli (SCE)

5 L esperimento di Taylor dimostra che: la replicazione del DNA è semiconservativa nelle cellule degli eucarioti ogni cromatidio e costituito da una doppia elica di DNA inoltre dimostra l esistenza di un fenomeno particolare: gli scambi fra cromatidi fratelli (sister chromatid exchange, SCE) L esperimento di Taylor sarà analizzato nel file «cromosomi»

6 IL MECCANISMO DELLA REPLICAZIONE DEL DNA NEI PROCARIOTI ED EUCARIOTI

7 Il modello di replicazione semiconservativa

8 La sintesi del DNA richiede desossiribonucleosidi trifosfati ed un complesso innesco 3 -OH: stampo Si appaiano i desossiribonucleosidi trifosfato, si elimina un pirofosfato e si forma il legame fosfodiesterico

9 Animazione : La chimica della sintesi del DNA 1)La sintesi del DNA richiede desossiribonucleosidi trifosfato e una struttura innesco: stampo 2)Ciascuno dei quattro desossiribonucleosidi (G C T A) possiede tre gruppi fosfato; Il gruppo α è il piu interno, il più prossimale al desossiribosio; il gruppo intermedio e il più distale sono indicati rispettivamente come fosfati β e γ. 3) Il complesso innesco:stampo ha due componenti importanti: lo stampo che è costituito da un singolo filamento di DNA che deve essere copiato e dirige l aggiunta dei desossiribonucleotidi complementari; l innesco che è complementare allo stampo, ma molto più corto e deve presentare alla sua terminazione un gruppo 3 -OH; questo terminale verrà allungato man mano che i nucleotidi verranno aggiunti.

10 (Continuazione dell animazione la chimica della sintesi del DNA) 4)Il DNA è sintetizzato allungando il terminale 3 dell innesco L idrolisi del pirofosfato è il motore per la sintesi del DNA Il gruppo 3 OH dell innesco attacca il fosfato α del desossiribonucleoside in una reazione di sostituzione nucleofila; si libera un pirofosfato che è costituito dai gruppi fosfato β e γ; 5)l energia liberata in questa reazione non è sufficiente; ci vuole un energia addizionale, data dall idrolisi del pirofosfato in due gruppi fosfato; questa reazione è catalizzata dalla pirofosfatasi. 6)Il processo si ripete e il DNA è sempre costruito estendendo il 3 -OH dell innesco; il filamento stampo dirige quale dei 4 desossiribonucleotidi deve essere aggiunto; 7)durante la replicazione il desossiribonucleoside trifosfato che appaia la sua base con quella dello stampo è altamente favorito per la sua addizione

11 Animazione Watson\ch08_polymerization.html

12 Alcuni problemi nella replicazione del DNA La direzione della sintesi La necessità di un gruppo 3 -OH che serve da innesco per la sintesi All inizio della replicazione l innesco 3 -OH è dato un RNA primer La rimozione dell RNA primer e il suo rimpiazzamento con DNA.

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14 Sintesi semi-discontinua del DNA Le DNA polimerasi sanno costruire il DNA solo nella direzione 5-3, come può essere costruito il filamento che ha polarità opposta? Esso viene costruito sempre nella direzione 5-3, ma a piccoli frammenti (detti di Okazaki)

15 Semi-discontinuità della sintesi forcella di replicazione asimmetrica

16 La sintesi del DNA necessita di un gruppo 3 -OH come innesco Se la sintesi è già iniziata, l estremità 3 - OH è offerta dall ultimo nucleotide aggiunto

17 Come può essere iniziata la sintesi del DNA? All inizio non esiste alcun terminale 3 OH da utilizzare come innesco. Il problema è risolto tramite la costruzione di un RNA innesco che offre il proprio terminale 3 OH per legare il primo nucleotide L inizio di un nuovo filamento di DNA richiede un innesco di RNA

18 La forcella di replicazione Il DNA neosintetizzato L RNA innesco

19 L RNA innesco viene eliminato Gli RNA primer devono essere rimossi affinchè la replicazione possa essere completata e sostituito con nuovo DNA la ligasi ristabilisce la continuità

20 La ligasi salda i gaps fra nucleotidi adiacenti formando un complesso Enzima-AMP

21 La sintesi di un frammento di Okazaki richiede: La sintesi di un primer La sua estensione (nella costruzione di DNA) La sua rimozione Il riempimento del gap Il legame conclusivo

22 Le DNA Polimerasi oltre a polimerizzare sanno anche correggere, ( hanno attività esonucleasica, di correzione di bozze, proofreading) L ultima base inserita deve essere correttamente appaiata, altrimenti viene eliminata

23 La DNA polimerasi puo essere raffigurata come una mano nella quale possiamo distinguere un palmo, il dominio delle dita, il pollice. La funzione catalitica e ad opera soprattutto del palmo e del dominio delle dita.

24 Il palmo ha attività polimerasica, ma anche esonucleasica (di correzione di bozze)

25 Sito catalitico polimerasico e sito esonucleasico Nel palmo della DNA polimerasi oltre ad un sito catalitico polimerasico e presente un sito esonucleasico che permette alla polimerasi di svolgere l attività di correzione di bozze (proofreading), in direzione 3-5. In media, la DNA polimerasi inserisce un nucleotide non corretto ogni 10 5 nucleotidi polimerizzati; il sistema di correzione abbassa la presenza di errore a 1ogni 10 7 ; l ulteriore livello di accuratezza, 1 errore su nucleotidi polimerizzati, e determinato dai processi di riparazione del DNA che verranno studiati in seguito

26 Animazione Watson\ch08_polymerization.html

27 DNA polimerasi nella replicazione del DNA Eucarioti: DNA polimerasi a primasi DNA polimerasi ᵟ DNA polimerasi ε Procarioti DNA polimerasi III DNA polimerasi I DNA polimerasi ancelle o di translesione (TLS) operano replicando attraverso il danno; replicano il DNA anche se presente un danno Procarioti DNA Pol IV, V Eucarioti DNA Pol ζ, κ, η, ι

28 Oltre alle DNA polimerasi altre proteine partecipano alla sintesi del DNA: SSB (Single Strand Binding Protein) DNA elicasi DNA topoisomerasi DNA primasi Sliding clamp (pinza) RNAsi H (mammiferi) DNA ligasi

29 Le proteine SSB stabilizzano il DNA a singolo filamento

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31 Il problema di avvolgimento che si verifica durante la replicazione del DNA Rotazione dell elica di DNA davanti alla forcella Le DNA topoisomerasi impediscono al DNA di aggrovigliarsi durante la replicazione

32 Sintesi di RNA primer da parte della DNA Primasi Come vedremo in seguito la DNA primasi interagisce nel suo meccanismo d azione con la elicasi

33 Animazione: la replicazione del DNA (Le proteine che intervengono nella sintesi del DNA)

34 Animazione: la replicazione del DNA Le proteine che intervengono nella sintesi del DNA Testo animazione: 1)Molte proteine sono coinvolte nella sintesi del DNA; queste proteine includono le DNA elicasi, le SSB (single stranded DNA binding proteins), le topoisomerasi, la primasi, le DNA polimerasi, l anello β (sliding DNA clump), l RNAsi H, la DNA ligasi 2) Le DNA elicasi sono una classe di enzimi che associano l idrolisi di ATP alla separazione dei filamenti di DNA; le elicasi coinvolte nella replicazione del DNA sono esameri a forma di anello

35 3)La giunzione fra i filamenti stampo separati e la doppia elica del DNA non replicata è detta forcella di replicazione; essa si muove continuamente verso la doppia elica di DNA non replicata 4) Le proteine SSB si legano ai singoli filamenti di DNA e stabilizzano i filamenti separati prima che vengano replicati 5) Le topoisomerasi rimuovoni i superavvolgimenti prodotti dall apertura del DNA alla forcella replicativa 6) La replicazione del DNA richiede un RNA primer per poter iniziare; la primasi è una particolare RNA polimerasi che costruisce dei brevi RNA primers usando come stampo DNA a singolo filamento

36 7) La sintesi del DNA è catalizzata da un enzima chiamato DNA polimerasi; la DNA polimerasi è in grado di agire solo aggiungendo desossiribonucleosidi trifosfato all estremità 3 di un polinucleotide. Poiché la doppia elica del DNA è costituita da due filamenti antiparalleli, un filamento è costruito in modo continuo verso la forcella di replicazione ed un altro in modo discontinuo in senso contrario alla forcella di replicazione; 8) Il filamento replicato in modo continuo è detto leading strand o filamento continuo, o veloce, o guida; il filamento replicato in modo discontinuo è detto lagging strand o filamento lento o ritardato o discontinuo 9) E richiesto un secondo affinchè la DNA polimerasi si leghi al DNA, ma una volta che la sintesi è iniziata, essa può aggiungere fino a 1000 nucleotidi al secondo per ciascun filamento di DNA. L abilità di un enzima a catalizzare molte reazioni prima di rilasciare il substrato si chiama processività

37 10)Per aumentare il grado di processività della DNA polimerasi uno sliding clump (anello β) si lega al DNA e alla DNA polimerasi, tenendoli insieme 11) Il lagging strand è sintetizzato in modo discontinuo in piccoli frammenti 12) I corti frammenti di DNA sintetizzati sul lagging strand sono chiamati frammenti di Okazaki (essi sono costituiti da 100 a 1000 paia di basi); ogni frammento di Okazaki inizia con un RNA primer; per completare la sintesi del DNA, ogni RNA primer deve essere rimosso. La RNAsi H degrada in modo specifico gli RNA che sono appaiati con il DNA (H sta per hibrid, come è per DNA:RNA) 13) La rimozione degli RNA primers lascia dei gaps nella doppia elica del DNA; questi gaps sono riempiti dalla DNA polimerasi 14) Le interruzioni sono poi saldate dalla DNA ligasi

38 Animazione Watson\ch08_replication.html

40 Coordinamento tra la sintesi del filamento continuo e discontinuo

41 Dna B(elicasi) e Dna G primasi (primasi) costituiscono il PRIMOSOMA

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44 Coordinamento fra sintesi del filamento lento e quella del filamento veloce

45 La sintesi dei due filamenti e simultanea, ma i punti che vengono replicati non sono corrispondenti nei due filamenti La sintesi del filamento veloce e lento avviene in modo coordinato Il filamento ritardato si ripiega per permettere alla subunità catalitica della DNA Polimerasi del filamento ritardato di associarsi a quella del filamento guida

46 Figure 5-19a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

47 Figure 5-19b,c Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

48 animazioni a marzo\05.4_replication_i.mov

49 animazioni a marzo\05.5_dna_replication_fork.mov

51 05.5 Repliation II. In a replication fork, two DNA polymerases collaborate to copy the leadingstrand template and the laggingstrand template DNA. In this picture, the DNA polymerase that produces the lagging strand has just finished an Okazaki fragment. The clamp that keeps the lower DNA polymerase attached to the lagging strand dissociates, and the DNA polymerase temporarily releases the laggingstrand template DNA. As the DNA helicase continues to unwind the parental DNA, the primase becomes activated and synthesizes a short RNA primer on the growing lagging strand. The DNA polymerase binds to the DNA again and becomes locked in by the clamp. The polymerase uses the RNA primer to begin a short copy of the lagging strand-template DNA. The polymerase stalls when it reaches the RNA primer of the preceding Okazaki fragment, and the entire cycle repeats.

52 Coordinamento tra la sintesi del filamento continuo e discontinuo II Modello (vedi anche animazione)

53 La composizione della polimerasi III oloenzima

54 * Nuovo modello per spiegare il coordinamento della sintesi del DNA fra filamento veloce e lento III Modello (anche questo è detto a trombone, ma a differenza del II, qui si propone la presenza di due cori della DNA polimerasi III sul filamento lento ed uno sul filamento veloce)

55 In questo modello viene sfruttata la flessibilità della molecola del DNA e della proteina τ. * E da ricordare che a livello della forcella di replicazione il filamento guida e quello discontinuo sono sintetizzati simultaneamente. Ciò limita la quantità di DNA a singolo filamento presente nella cellula durante la replicazione. Per coordinare la replicazione di entrambi i filamenti molte DNA polimerasi operano a livello della forcella. L azione coordinata di queste polimerasi è facilitata dal legame fisico che le tiene unite in un grande complesso multiproteico detto DNA Pol III Oloenzima. Oloenzima indica un complesso multiproteico nel quale una proteina che ha attività catalitica (core) è associata ad altri componenti che regolano la sua funzione. La DNA Pol III Oloenzima include tre copie dell enzima DNA Pol III «core» e una copia del caricatore dello sliding clamp che comprende tre copie della proteina τ, ognuna delle quali lega una unità del core della DNA Pol III.

56 * Tre cori della DNA Pol III sono presenti, contattati da tre proteine Tau: un core lavora sul filamento continuo, due cori sul filamento discontinuo

57 * Modalità di utilizzo dei due cori della DNA polimerasi del filamento discontinuo Questo modello propone che due cori della DNA polimerasi sul filamento discontinuo inizino alternativamente la sintesi dei nuovi frammenti di Okazaki la «prima» polimerasi ha concluso la costruzione di un frammento di Okazaki, la «seconda» sta ancora lavorando

58 * a)la DNA polimerasi III interagisce con la DNA elicasi grazie ai fattori tau che legano gli enzimi core della DNA polimerasi III. Un core sintetizza il filamento guida mentre gli altri due il filamento discontinuo. Le SSB rivestono il filamento di DNA a singolo filamento (mostrate solo nel filamento discontinuo

59 * elicasi b) La DNA primasi che era precedentemente associata con l elicasi (non mostrato in questa figura ) ha portato alla sintesi di un nuovo primer a RNA (freccia blu) sul filamento discontinuo mentre intanto una DNA polimerasi del filamento discontinuo sta proseguendo la sintesi di un frammento di Okazaki (freccia rossa)

60 * c)subito dopo la sintesi di un nuovo primer a RNA il caricatore dello sliding clamp assembla una sliding clamp (freccia blu) in corrispondenza della giunzione innesco stampo appena formatasi, mentre una DNA polimerasi del filamento discontinuo sta ancora proseguendo la sintesi di DNA del frammento di Okazaki (freccia rossa)

61 Una DNA polimerasi del filamento discontinuo sta completando la sintesi di DNA di un frammento di Okazaki (freccia rossa), mentre l altra polimerasi sempre del filamento discontinuo sta iniziando la sintesi di DNA dall innesco RNA di un nuovo frammento di Okazaki d) La seconda DNA polimerasi del filamento discontinuo riconosce la sliding clamp caricata sul DNA e inizia la costruzione di un nuovo frammento di Okazaki (freccia blu) *

62 Quando la prima DNA pol del filamento discontinuo raggiunge l estremità dello stampo su cui sta costruendo il frammento di Okazaki essa viene rilasciata dallo sliding clamp (freccia rossa). Questa prima DNA pol III del filamento discontinuo è disponibile per il riconoscimento del prossimo complesso tra primer a RNA e sliding clamp che si assembla sullo stampo. L altra DNA pol è ancora impegnata nella sintesi del frammento di Okazaki (freccia blu) la «prima» polimerasi ha concluso la costruzione di un frammento di Okazaki, la «seconda» sta ancora lavorando nella costruzione dell altro frammento di Okazaki *

63 Il completamento della sintesi del DNA e la stabilità cromosomica Il problema dei telomeri

64 I TELOMERI E IL CAPPING TELOMERICO I Telomeri sono strutture composte da DNA e proteine. Il DNA telomerico è composto da un numero variabile di ripetizioni della sequenza nucleotidica 5 -TTAGGG-3 con il filamento di DNA ricco in Guanina che sporge in 3 Il Telomero ha almeno 2 funzioni: Proteggere le estremità cromosomiche attraverso il capping telomerico Garantire la corretta replicazione delle estremità del DNA

65 I telomeri proteggono le estremità cromosomiche dalla degradazione, fusione ed incompleta replicazione e pertanto sono necessari per la stabilità cromosomica Il problema dei telomeri L estremità 3 del DNA di ciascun cromosoma si estende come singolo filamento oltre l estremità 5. Cio e dovuto all incapacità della DNA polimerasi di replicare il DNA quando il primer e rimosso all estremità 5 del lagging

66 La maggioranza degli eucarioti usa una particolare polimerasi chiamata telomerasi per risolvere il problema della replicazione delle estremità del DNA. La telomerasi e composta da una parte proteica e da RNA. L RNA della telomerasi umana contiene la sequenza UAACCCUAA, che viene usata come stampo per aggiungere sequenze all estremità 3 del DNA. Pertanto: -La telomerasi estende l estremità 3 del DNA -La telomerasi non necessita di uno stampo a DNA -L RNA della telomerasi serve come stampo per costruire DNA

67 Alberts\05.6-telomere_replication.mov

68 Adattamento Sintesi di DNA Traslocazione Nuova sintesi di DNA

69 Animazione Watson\ch08_telomerase.html

70 Il primer per la costruzione del filamento complementare a quello che e stato allungato dalla telomerasi (rosso) potrebbe essere dato dal 3 -OH di questo stesso filamento che si ripiega verso l estremita 5 dell altro filamento (incompleto)

71 Struttura del telomero nei cromosomi di mammifero

72 Esiste un equilibrio dinamico fra accorciamento ed allungamento del telomero; una volta che il telomero e stato allungato si ha poi l azione di nucleasi che tagliano alcune sequenze e si realizza poi la struttura definitiva ottenuta anche con l associazione di particolari proteine

73 -La telomerasi è attiva nelle cellule germinali mentre non è attiva nella maggioranza delle cellule somatiche. Pertanto la lunghezza dei telomeri nelle cellule germinali rimane circa la medesima durante la vita di un organismo; i telomeri delle cellule somatiche, invece, diventano sempre piu corti nel corso della vita di un organismo, perche ad ogni divisione vengono perdute sequenze telomeriche

74 Ricerche recenti dimostrano che in alcuni tipi di cellule somatiche la telomerasi e attiva; alla fine del processo che aggiunge sequenze telomeriche c e poi anche una perdita di sequenze dovuta all azione di nucleasi che agiscono alla fine del processo; per cui la lunghezza definitiva del telomero ad ogni replicazione e un equilibrio dinamico fra l aggiunta e la perdita di sequenze. La lunghezza del telomero e stabilita non dalla telomerasi ma dall azione di altre proteine associate al telomero.

75 -Le cellule cancerogene possono dividersi in modo indefinito; la telomerasi in queste cellule e attiva. Viene suggerito che l instabilità cromosomica presente nelle cellule cancerogene porti ad una riattivazione della telomerasi in queste cellule.

76 -Pazienti con sindrome prematura di vecchiaia hanno telomeri piu corti in alcune cellule se paragonati con quelli presenti in controlli della stessa età. Le cellule dei pazienti con questa sindrome se vengono poste in coltura hanno difficoltà ad accrescersi. E stato dimostrato che quando i telomeri sono troppo corti l accrescimento viene bloccato.

77 -Si pensa che l inattivazione della telomerasi potrebbe servire per impedire l accrescimento delle cellule tumorali; in questo caso, tuttavia, anche le cellule germinali sarebbero inattivate. Infatti, anche le cellule germinali hanno la telomerasi attiva.

78 Aberrazioni cromosomiche dovute ad alterazioni dei telomeri a b c d

79 E F A B Interscambi cromosomici e cromosomi ad anello in cellule con telomeri instabili C D