Le molecole biologiche. Gli acidi nucleici

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1 Le molecole biologiche Gli acidi nucleici

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3 A differenza delle proteine che costituiscono le strutture cellulari e ne mediano gran parte delle funzioni Gli acidi nucleici rappresentano il substrato molecolare dell informazione genetica che le cellule utilizzano per costruire (sintetizzare) le proteine di cui esse hanno bisogno.

4 Il termine acidi nucleici raggruppa due diversi tipi di macromolecole Entrambe sono polimeri lineari di molecole più semplici chiamate nucleotidi, e sono Acido desossiribonucleico, i.e. DNA Acido ribonucleico, i.e. RNA

5 Un po di storia Friederich Miescher ( ) Miescher proveniva da una famiglia molto in vista nella comunità scientifica: il padre e lo zio erano infatti stati professori di anatomia all'università di Basilea. Timido ed intelligente, il giovane Miescher si avviò verso la carriera di chimico fisiologo. Iniziò a studiare i linfociti, ma Felix Hoppe- Seyler lo incoraggiò a studiare i leucociti. Miescher era infatti interessato soprattutto nello studio della chimica del nucleo: dal momento che era difficile ottenere un numero di linfociti sufficienti per uno studio, la scelta ricadde sui leucociti, che erano noti per essere il principale componente del pus, ottenibile facilmente dalle garze usate nei vicini ospedali, affollati visto il conflitto francoprussiano. Per evidenziare il nucleo dei leucociti presenti nel pus, Miescher dovette mettere a punto un protocollo totalmente nuovo. Per recuperare le cellule dai bendaggi, utilizzò una soluzione salina a base di solfato di sodio. Per separare i nuclei dai citoplasmi, sottopose le cellule ad una soluzione alcalina, seguita da una acida. Il precipitato formatosi in seguito a tale processo fu, appunto, chiamato nucleina. Miescher morì nel 1895 di tubercolosi, dopo aver condotto anche un laboratorio della Max Planck Society a Tubinga ed un istituto di ricerca di Basilea che, dopo la sua morte, prese il suo nome.

6 Un po di storia Miescher aveva avuto il merito di isolare e scoprire la nucleina, ma non aveva dato alcuna interpretazione scientifica in merito al suo significato biologico. Questo fece sorgere l interrogativo nella comunità scientifica, se la nucleina altro non fosse che il principale componente della cromatina, cioè quella sostanza complessa e fortemente colorabile che gli istologi osservavano nel nucleo delle cellule di tutti gli organismi superiori. Tale ipotesi fu accettata comunemente, e all inizio del XX secolo quando ormai il ruolo della cromatina e dei cromosomi come elementi fondamentali dei caratteri ereditari era ben chiaro, fu avanzata l ipotesi che la nucleina degli organismi superiori fosse più complessa da quella degli organismi inferiori. Ciò diede un nuovo impulso allo studio della nucleina, portando alla scoperta che essa conteneva due basi azotate puriniche (adenina e guanina) e due basi azotate piramidiniche (timina e citosina) e lo zucchero pentoso 2-deossiribosio. Negli stessi anni venne anche scoperta l esistenza di un secondo tipo di acido nucleico caratterizzato dallo zucchero ribosio e dalla presenza della base piramidinica uracile al posto della timina. Giungendo dunque alla formulazione definitiva circa la presenza del DNA e dell RNA

7 Un po di storia Tuttavia quando si provò ad analizzare la nucleina estratta da organismi diversi, ci si rese conto la composizione chimica era sostanzialmente simile, facendo decadere l ipotesi di una nucleina più complessa a seconda della filogenesi dell organismo. Ciò fece cadere l interesse verso questa sostanza come la responsabile della trasmissione dei caratteri genetici, spostando invece erroneamente l attenzione sulle proteine del nucleo.

8 Un po di storia I biologi restarono piuttosto scettici e poco interessati rispetto al DNA, che era oggetto di studio per la maggior parte di chimici. Questo fino al In quell anno Oswald T. Avery, M. McLeod ed M. McCarty causarono parecchio sconvolgimento nell ambiente accademico della biologia. Il gruppo di ricerca aveva infatti ripreso gli esperimenti di un batteriologo inglese di nome F.Grifith che nel 1928 aveva condotto un esperimento circa il cosiddetto principio trasformante dello pneumococco Diplococcus pneumoniae, il batterio della polmonite.

9 Un po di storia Immagine 2.36 Basi biologiche Oswald T. Avery, M. McLeod ed M. McCarty replicando gli esperimenti di Griffith, dimostrarono inequivocabilmente che il principio trasformante era il DNA e che invece nessuna trasformazione avveniva con le sole proteine del nucleo.

10 Un po di storia Nel 1950 l idea che fosse il DNA e non le proteine a trasmettere l informazione genetica era dunque ormai accettata. In questi anni, il biochimico Ervin Chargaff riuscì a dimostrare che il DNA è costituito da quantità uguali di basi puriniche e di basi piramidiniche. Guanina = Citosina e Adenina = Timina. Tale conclusione venne appunto definita come regola di Chargaff

11 Un po di storia In quegli anni inoltre il lavoro dei biochimici si intrecciò fortemente con il lavoro degli strutturisti che potevano avvalersi di una nuova tecnica, la cristollagrafia a raggi X

12 Un po di storia I tempi erano ormai maturi per la scoperta della struttura del DNA ed a lavoro su tale obiettivo vi erano tre diversi gruppi di ricerca: California Institute of Technology Pasadena Kings College Londra Cambridge Linus Pauling James D. Watson & Francis Crick

13 Un po di storia Linus Pauling Aveva in precedenza scoperto la struttura ad alpha-elica delle proteine, e le forze che legano le molecole Aveva ottenuto delle immagini di diffrazione che mostravano che il DNA avesse una struttura elicoidale. Ma non chiarivano quante effettivamente fossero le catene di DNA James D. Watson & Francis Crick Scoprirono la struttura a doppia elica del DNA.

14 Un po di storia Ciò rese evidente che l informazione genetica consisteva nella sequenza delle basi azotate lungo la doppia elica, ma spiegò anche le modalità di duplicazione del DNA dalla cellula madre alla cellula figlia. Inoltre spiegarono la regola di Chargaff evidenziando i legami idrogeno che legano la guanina alla citosina e la timina alla adenina. Per tutti questi grandi risultati Crick, Watson e Wilkins ricevettero nel 1962 il premio Nobel per la medicina e la fisiologia.

15 I nucleotidi Mentre le proteine sono polimeri caratterizzati dal legame di amminoacidi Gli acidi nucleici legano fra loro i nucleotidi. Gli amminoacidi sono in totale 20. I nucleotidi sono drasticamente di meno e sono soltanto 4 Immagine 2.37 Basi biologiche

16 I nucleotidi Mentre le proteine sono polimeri caratterizzati dal legame di amminoacidi Gli acidi nucleici legano fra loro i nucleotidi. Gli amminoacidi sono in totale 20. I nucleotidi sono drasticamente di meno e sono soltanto 4 1. C1 Lega la base azotata 2. C2 Lega un gruppo ossidrile OH nel ribosio/ due H nel desossiribosio 3. C3 Lega sempre un OH 4. C4 Lega un atomo di O che rende ciclica la molecola di zucchero 5. C5 Lega il gruppo fosfato

17 I nucleotidi Mentre le proteine sono polimeri caratterizzati dal legame di amminoacidi Gli acidi nucleici legano fra loro i nucleotidi. Gli amminoacidi sono in totale 20. I nucleotidi sono drasticamente di meno e sono soltanto Immagine 2.37 Basi biologiche 3 2

18 I nucleotidi Mentre le proteine sono polimeri caratterizzati dal legame di amminoacidi Gli acidi nucleici legano fra loro i nucleotidi. Gli amminoacidi sono in totale 20. I nucleotidi sono drasticamente di meno e sono soltanto 4 Fosforilazione Nucleoside, Desossiribonucleoside Ribonucleoside Nucleotide, Desossiribonucleotide Ribonucleotide

19 Il primo gruppo fosfato, chiamato alpha può a sua volta legare fino ad altri due gruppi fosfati (beta e gamma) Questo denota il nucleotide identificandoli come fosforilati, difosforilati e trifosforilati Immagine 2.38 Basi biologiche

20 Nucleotidi trifosforilati come deposito energia chimica L energia del legame di due gruppi fosfato costituisce la maggiore sorgente energetica di pronto utilizzo all interno delle cellule. In particolare l ATP ed il GTP (trifosfati) in caso di bisogno vengono defosforilati di una o due unità con liberazione di un fosfato inorganico. In caso di energia in eccesso le stesse reazioni avvengono in direzione opposta

21 Nucleotidi trifosforilati come deposito energia chimica Questi processi energetici vengono fondamentalmente utilizzati per due scopi principali: Glicolisi degradazione anaerobica del glucosio nel citoplasma Respirazione cellulare nei mitocondri

22 Altre funzioni dei nucleotidi Oltre ad essere i componenti degli acidi nucleici, ed essere parte del ciclo energetico delle cellule i nucleotidi possono essere implicati nei processi di trasduzione del segnale, ossia la risposta intracellulare all arrivo di messaggeri extracellulari come gli ormoni od i neurotrasmettitori. Tale processo avviene attraverso la ciclizzazione dei nucleotidi. Ad esempio, l ATP ed il GTP camp e cgmp

23 Il legame fosfodiesterico La classica modalità biologica di creare macromolecole unendo molecole più piccole è osservabile anche nel caso degli acidi nucleici. Mentre i polisaccaridi sono legati dal legame glicosidico e le proteine dal legame polipeptidico, gli acidi nucleici utilizzano il legame fosfo-diesterico. Immagine 2.39 Basi biologiche Tale nome deriva dal fatto che ad unirsi sono una molecola di acido fosforico col C5 di un nucleotide e con il C3 del secondo nucleotide. Tale legame si sviluppa in 3 fasi: 1) I nucleotidi vengono trifosforilati in C5 2) In presenza del secondo nucleotide due gruppi fosfati vengono tagliati 3) L energia derivante dalla liberazione del pirofosfato viene usata per legare il gruppo fosfato in C3 del secondo nucleotide

24 La struttura del DNA Come scoperto da Crick e Watson, il DNA è composto da due filamenti polinucleotidici, legati fra loro, avvolti su se stesso con un andamento a spirale, formando una doppia elica tipicamente destrorsa. Le due catene polinucleotidiche hanno fra loro un andamento antiparallelo (cioè direzioni 5 3 opposte). Immagine 2.40 Basi biologiche

25 La struttura del DNA Le due catene polinucleotidiche sono tenute insieme dal legame fra le varie coppie di basi azotate, in particolare una base purinica si lega, tramite legami H, sempre ad una base piramidinica. Si vengono così a formare due coppie: Timina Adenina (legate da due legami H) Guanina Citosina (legate da tre legami H) Questo rende i due filamenti di DNA complementari fra loro, legati stabilmente visto il grande numero di basi azotate legate fra loro (Kbase) Immagine 2.40 Basi biologiche Data la regolarità dell appaiamento fra una purina ed una piramidinica, il DNA ha una distanza costante fra i due filamenti, e quindi la doppia elica ha un diametro sempre uguale in ogni suo punto. Vi sono inoltre due solchi che percorrono la superfice della molecola chiamati solco minore e solco maggiore, che permettono ad alcune proteine chiamate fattori di trascrizione, di legarsi in quei determinati punti e conoscere la sequenza di basi azotate senza aprire la doppia elica. Nel legame fosfodiesterico ogni gruppo fosfato ha un gruppo acido libero di ionizzarsi. Questo conferisce alla molecola una spiccata qualità di idrofilia che la rende solubile nel nucleo acquoso della cellula Di contro le basi azotate all interno della molecola restano un compartimento idrofobo, privo di acqua lasciando le basi protette da aggressivi chimici idrofili.

26 I cromosomi All interno del nucleo delle cellule eucariote il DNA forma un numero limitato di grosse molecole lineari dette cromosomi Nell essere umano nel nucleo di ogni cellula sono contenuti 46 cromosomi

27 La replicazione del DNA Crick e Watson, intuirono un altra importante caratteristica del DNA, ovvero la capacità di replicare se stesso e dare origine a due molecole figlie identiche all originale, tramite un meccanismo di replicazione semiconservativo. Ovvero ogni molecola figlia riceve uno dei due filamenti originari mentre il secondo viene sintetizzato nel momento della duplicazione. Tale operazione avviene di norma nella fase S del ciclo cellulare. Immagine 2.41 Basi biologiche

28 La replicazione del DNA L operazione di reduplicazione del DNA si può sintetizzare in 5 fasi. 1) Il processo inizia in punti specifici denominati siti Ori, in questi punti la molecola va incontro ad un processo di denaturazione apportato da un enzima chiamato elicasi, con la rottura dei legami H che tenevano uniti i due filamenti. A questo punto intervengono una serie di proteine che stabilizzano la molecola mantenendo aperti i due filamenti, dando così origine alla cosiddetta forchetta di replicazione. All interno di questa regione ormai aperta, possono accedere i nucleotidi trifosfati che formeranno la nuova catena, guidati da un enzima, chiamato DNA polimerasi DNA-dipendente Immagine 2.42 Basi biologiche

29 La replicazione del DNA 2) All interno di ogni forchetta di replicazione i singoli filamenti che prima formavano da doppia elica, agiscono da stampo per la sintesi dei filamenti complementari. Infatti questi filamenti essendo aperti hanno le basi azotate ai numerosi nucleotidi trifosfati presenti all interno del nucleo. Quindi sotto l impulso dell agitazione termica accade che basi fra loro complementari si leghino fra loro con legami H, dando così il tempo all enzima DNA polimerasi di legare fra loro le basi del nuovo filamento.

30 La replicazione del DNA 3) Dal momento che la sintesi del DNA può avvenire solo in direzione 5' 3' e che l'origine di replicazione (rappresentato da una specifica sequenza di nucleotidi) non si trova mai all'estremità 5' o 3' (motivo per cui si forma la cosiddetta bolla replicativa), solo uno dei due filamenti appartenenti alla stessa corsia, detto filamento guida (o filamento leader, filamento veloce o, in inglese, leading strand), può essere sintetizzato in maniera continua, utilizzando un unico innesco.

31 La replicazione del DNA 4) L'altro filamento, invece, chiamato filamento in ritardo (detto anche filamento lento o lagging strand in inglese), deve essere sintetizzato in direzione opposta al leading (in direzione 3'- 5'), sotto forma di piccoli frammenti discontinui, definiti appunto frammenti di Okazaki. Per tale motivo, in realtà, il filamento tardivo è dunque composto da diversi filamenti, la cui sintesi inizia vicino alla forca replicativa a partire da un innesco (in inglese primer) da parte dell'enzima DNA polimerasi. Il frammento viene poi legato al frammento successivo grazie al DNA ligasi Si noti che la replicazione del DNA è bidirezionale, a opera di forchette di replicazione che operano in entrambe le direzioni lungo il doppio filamento di DNA; pertanto un singolo filamento di DNA è contemporaneamente guida per la duplicazione in una direzione e in ritardo in direzione opposta; i frammenti di Okazaki si formano sulle "metà" percorse dalle forchette di replicazione in direzione 3' 5', quindi su entrambi i filamenti della doppia elica del DNA.

32 La replicazione del DNA 5) Tutte le tappe fin qui descritte vengono ripetute in ogni punto Ori, per tutta la lunghezza del DNA

33 La struttura dell RNA A differenza del DNA l RNA è formato da un singolo filamento nucleotidico, formato da ribonucleotidi con la timina sostituita dall uracile. Sebbene sia un singolo filamento, l RNA si avvolge su se stesso formando un gran numero di forcine a doppia elica. Queste forcine si formano in presenza di particolari sequenze nucleotidiche dette palindromiche, fra loro complementari. In modo analogo al DNA la doppia elica è stabilizzata da legami idrogeno fra le basi azotate. Tutte queste caratteristiche conferiscono all RNA delle particolari funzioni. Immagine 2.43 Basi biologiche In particolare: 1. Veicolazione dell informazione genetica dal DNA alle proteine (RNA messaggero) 2. Funzioni strutturali come costituenti dei ribosomi (rrna) 3. Trasportatori degli amminoacidi nella sintesi delle proteine (trna) 4. Catalisi di varie reazioni chimiche, connesse con il metabolismo degli acidi nucleici ribozimi 5. Regolatore dei processi della trascrizione e traduzione small RNA

34 La trascrizione del DNA in RNA Il processo della sintesi delle varie molecole di RNA, detta anche trascrizione del DNA in RNA, è molto simile al processo di replicazione del DNA ma con alcune sostanziali differenze. Immagine 2.44 Basi biologiche Utilizza i ribonucleotidi trifosfato (ratp, rgtp, rctp, rutp) Il processo è catalizzato dall enzima RNA polimerasi DNA-dipendente Mentre il processo della replicazione di DNA si svolge sull intera molecola, la trascrizione dell RNA è di tipo locale e riguarda solo una sequenza nucleotidica, più o meno lunga, definita gene

35 I geni Il termine gene indica uno specifico segmento cromosomico, la cui sequenza nucleotidica codifica la sequenza amminoacidica che costituisce la struttura primaria di una proteina. I nostri cromosomi portano complessivamente circa geni

36 Il gene è in genere formato da una sequenza codificante e da una sequenza regolatrice in genere disposte a monte (verso l estremità 5 ) rispetto alla sequenza codificante. Inoltre la parte della sequenza regolatrice più vicina alla sequenza codificante, è definita promotore del genere. Dal lato opposte c è inoltre una particolare sequenza detta sito di poliadenilazione che servirà da punto di attacco di una coda di poliadenine (polia) durante il processo della maturazione dell RNA messaggero

37 La trascrizione del DNA in RNA Nella regione regolativa di ogni gene, ci sono delle corte sequenze chiamate elementi genici, questi vengono riconosciuti da proteine specifiche chiamate fattori di trascrizione. Quando la cellula ha bisogno di una particolare proteina, i fattori di trascrizione si legano alla regione promotore del gene che codifica quella particolare proteina consentendo alla RNA polimerasi di iniziare la trascrizione. Che avviene tipicamente in tre fasi. Immagine 2.45 Basi biologiche

38 La trascrizione del DNA in RNA 1. INIZIO. I fattori di trascrizione si legano al DNA in corrispondenza del gene specifico. Una volta presente questo legame, può arrivare la RNA polimerasi che dopo la denaturazione della doppia elica, userà uno solo dei due filamenti, come stampo. 2. ALLUNGAMENTO. La RNA polimerasi si libera dei fattori di trascrizione ed inizia a scorrere in direzione 3 5 polimerizzando l RNA in direzione TERMINE. L allungamento prosegue fin quando l RNA polimerasi incontra una sequenza nucleotidica chiamata sito di terminazione. A questo punto questo filamento di RNA chiamato trascritto primario si stacca e andrà incontro ad alcuni processi che porteranno alla sua maturazione.