Le variazioni del DNA causa di malattie ereditarie

Transcript

1 Le variazioni del DNA causa di malattie ereditarie

2 Una mappa del corso Medicina Genetica Medicina Genomica Malattie monogeniche Poligenia e genetica dei caratteri continui Genetica delle popolazioni Mutazioni Citogenetica Mendel Darwin Test genetici Malattie multifattoriali Genetica del comportamento Genetica del cancro

3 Variabilità genetica La creazione di una variabilità genetica è uno dei motori, insieme alla selezione naturale, della evoluzione Moltissimi meccanismi molecolari sono fisiologicamente orientati a tale creazione (deaminazione della 5-metil-citosina, (. ecc ricombinazione, trasposizione

4 La mutazione è un evento naturale Deaminazione della 5- metilcitosina

5 Frequenza di mutazioni per generazione La variabilità genetica non è un incidente ma la causa della vita sulla terra Frequenza media di mutazione nei mammiferi Mutazioni puntiformi 0.5 x 10-8 per bp Microdelezioni (1-10bp) ~10-9 per bp Microinserzioni(1-10bp) ~0.5 x 10-9 per bp Eccezioni ( CpGs ) Siti ipermutabili C->T = 10x media punt. Simple Sequence Repeats ( -4 (10 rate x media indel DNA mitocondriale x media punt.

6 Variabilità genetica Differenza media tra due individui nel DNA = circa di basi Polimorfismi del DNA: SNP ect Variabilità genotipica Le variazioni che hanno un effetto Le variazioni che hanno un debole effetto negativo Variazioni causa di malattie complesse Variabilità fenotipica Mutazioni causa di malattia mendeliana Le variazioni che hanno un forte effetto negativo

7 Classificazione delle mutazioni Per tipo di localizzazione sul gene Mutazioni nelle regioni codogeniche Mutazioni nelle regioni regolatrici prossimali Mutazioni nelle regioni regolatrici distali Mutazioni nei siti di splicing Mutazioni negli introni Mutazioni nel sito di poliadenilazione Mutazioni nel CAP site Per tipo di variazione del DNA Mutazioni puntiformi (sostituzione di una singola coppia di basi) Piccole delezioni Piccole inserzioni Grandi delezioni Grandi inserzioni Ripetizioni Inversioni e riarrangiamenti complessi

8 Mutazioni Al 2015 HGMD contiene mutazioni in 4235 geni

9 Eterogeneità genetica Uno stesso fenotipo è prodotto da differenti anomalie genetiche Eterogeneità genetica è presente nella quasi totalità delle malattie genetiche Si divide in: ETEROGENEITA ALLELICA ETEROGENEITA DI LOCUS

10 Eterogeneità Allelica GENE A GENE A MALATTIA Differenti mutazioni nello stesso locus producono la stessa malattia Esempi: beta-talassemie, fibrosi cistica ecc. MALATTIA

11 Eterogeneità di Locus GENE A GENE B MALATTIA MALATTIA differenti mutazioni in differenti loci genetici producono lo stesso fenotipo Esempi: sordità congenita, atassia spinocerebellare, retinite pigmentosa ecc. Nella maggioranza dei casi di eterogeneità di locus è presente anche una eterogeneità allelica.

12 Mutazioni per anno (HGMD Professional release )

13 Mutazioni per tipo Missense/nonsense 56% Splicing 9% Regulatory 2% Small dele;ons 16% Small inser;ons 6% Small indels 1% Repeat varia;ons 0% Gross inser;ons/duplica;ons 1% Complex rearrangements 1% Gross dele;ons 7%

14 Frequenza per tipo 1% 0% 1% 2% 6% 16% 2% 6% 10% 56% Missense/nonsense Splicing Regulatory Small deletions Small insertions Small indels Repeat variations Gross insertions/duplications Complex rearrangements Gross deletions

15 Mutazioni Fibrosi Cistica Nella stessa malattia diversi tipi di mutazione

16 Mutazioni missenso/nonsenso

18 Mutazioni missenso/nonsenso Classificazione Per tipo di localizzazione sul gene Mutazioni nelle regioni codogeniche Mutazioni nelle regioni regolatrici prossimali Mutazioni nelle regioni regolatrici distali Mutazioni nei siti di splicing Mutazioni negli introni Mutazioni nel sito di poliadenilazione Mutazioni nel CAP site Per tipo di variazione del DNA Mutazioni puntiformi (sostituzione di una singola coppia di basi) Piccole delezioni Piccole inserzioni Grandi delezioni Grandi inserzioni Ripetizioni Inversioni e riarrangiamenti complessi

19 Transizioni e transversioni Purine Pirimidine Transversione Transizione

20 Mutazioni missenso Normale Mutato

21 Mutazioni nonsenso Normale Mutato

22

23 Mutazioni di splicing

25 Mutazioni di splicing: Classificazione Per tipo di localizzazione sul gene Mutazioni nelle regioni codogeniche Mutazioni nelle regioni regolatrici prossimali Mutazioni nelle regioni regolatrici distali Mutazioni nei siti di splicing Mutazioni negli introni Mutazioni nel sito di poliadenilazione Mutazioni nel CAP site Per tipo di variazione del DNA Mutazioni puntiformi (sostituzione di una singola coppia di basi) Piccole delezioni Piccole inserzioni Grandi delezioni Grandi inserzioni Ripetizioni Inversioni e riarrangiamenti complessi

26 Splicing

27 Splicing site consensus

28 Conseguenze fenotipiche delle mutazioni al sito di splicing Exon skipping Attivazione siti criptici

29 Conseguenze fenotipiche delle mutazioni al sito di splicing: L'exon skipping. Exon skipping: L'esone a valle (mutazione al sito 3') o a monte (mutazione al sito 5') della mutazione viene saltato,

30 Conseguenze dell exon-skipping 1) Un trascritto più corto (senza l'esone ma conservando la frame di lettura) 2) Un trascritto più corto (senza l'esone ma perdendo la frame di lettura - frame-shift - con conseguente reclutamento di uno stop codon)

31 Eterogeneità dei trascritti Alcune volte l'exon skipping produce differenti trascritti, in alcuni dei quali manca solo l'esone a valle, mentre in altri anche esoni vicini. (Es. La mutazione al sito di splicing al 5' dell'esone 5 del gene della betaesosoaminidasi (HEXA) causa una malattia chiamata Tay-Sachs. La specie predominante di mrna manca dell'esone 5, ma si riescono a trovare anche specie che mancano dell'esone 4, e dell'esone 4 e 5 insieme)

32 Conseguenze fenotipiche delle mutazioni al sito di splicing: L'utilizzazione di siti criptici La mutazione di un sito di splicing può fare emergere un sito criptico, normalmente non funzionante, che comincia a funzionare come sito di splicing. L'effetto sul trascritto è imprevedibile, dipendendo dalla posizione del sito criptico che si attiva. In generale L'attivazione di un sito criptico coinvolge il reclutamento di sequenze aberranti nella sequenza codogenica. Per potersi attivare un sito criptico, devono aversi le seguenti condizioni: Un certo numero di questi siti devono trovarsi nelle vicinanze del sito attivato Questi siti devono mostrare una sufficiente omologia con la sequenza consenso di splicing, per competere con il sito mutato

33 Exon skipping/attivazione siti criptici L'exon skipping sembra più frequente (il doppio) dell'attivazione di siti criptici. Esistono anche casi in cui coesistono entrambi i fenomeni.

34 Errori di splicing nella talassemia

35 Mutazioni regioni regolatrici

37 Classificazione delle mutazioni: zone regolatrici Per tipo di localizzazione sul gene Mutazioni nelle regioni codogeniche Mutazioni nelle regioni regolatrici prossimali Mutazioni nelle regioni regolatrici distali Mutazioni nei siti di splicing Mutazioni negli introni Mutazioni nel sito di poliadenilazione Mutazioni nel CAP site Per tipo di variazione del DNA Mutazioni puntiformi (sostituzione di una singola coppia di basi) Piccole delezioni Piccole inserzioni Grandi delezioni Grandi inserzioni Ripetizioni Inversioni e riarrangiamenti complessi

38 Mutazioni regioni regolatrici Mutazioni nelle regioni promotrici Mutazioni negli elementi promotori remoti ("locus controlling region" LCR) Polimorfismi dei promotori con effetto fenotipico

39 Promoter

40 Mutazioni nelle regioni promotrici prossimali Beta Talassemia. Sono state descritte una serie di mutazioni causanti beta-talassemia con moderata riduzione della sintesi di globina, nella regione promoter del gene della beta-globina (HBB) Due regioni sembrano particolarmente implicate: Il motivo CACCC localizzato tra -91 e -86 dal sito di inizio della trascrizione Il TATA box localizzato a -30 dal sito di inizio della trascrizione

41 Mutazioni nelle regioni promotrici remote La prima evidenza (1980) è una delezione di >40kb coinvolgente i geni G-gamma, A-gamma e delta delle globine ma non coinvolgente il gene beta causante una gamma-delta-beta-talassemia. Non solo il gene beta era intatto ma anche 2.5 kb a monte. Da allora numerose evidenze di situazioni analoghe coinvolgenti geni beta ed anche alfa. Modello: presenza di una regione di controllo del locus ("locus control region" LCR) molte basi a valle del locus, contenente un "enhancer" capace di dirigere l'espressione delle sequenze a valle.

42 Locus controlling region

43 Piccole delezioni Piccole inserzioni

45 Classificazione delle mutazioni:delezioni/inserzioni Per tipo di localizzazione sul gene Mutazioni nelle regioni codogeniche Mutazioni nelle regioni regolatrici prossimali Mutazioni nelle regioni regolatrici distali Mutazioni nei siti di splicing Mutazioni negli introni Mutazioni nel sito di poliadenilazione Mutazioni nel CAP site Per tipo di variazione del DNA Mutazioni puntiformi (sostituzione di una singola coppia di basi) Piccole delezioni Piccole inserzioni Grandi delezioni Grandi inserzioni Ripetizioni Inversioni e riarrangiamenti complessi

46 Piccole delezioni

47 Piccole inserzioni

48 Insdel Inserzione/delezione TAGGTTACTCATGCCATTGACTGGCCT TAGGTTACTCATGCCATTGACTGGCCT TAGGTTACTCTATTGACTGGCCT

49 Mutazione "frame-shift" L'inserzione o la delezione di nucleotidi in numero non multiplo di tre conduce alla rottura della fase di lettura, con conseguente formazione di una proteina differente che, generalmente, viene troncata precocemente da un codone di stop.

50 Frame-shift:delezione Normale Mutato

51 Frame-shift:inserzione Normale Mutato

52 Frameshift

53 Frameshift

54 Mutazioni talassemia

55 Ripetizioni DYNAMIC MUTATIONS (MUTAZIONI DINAMICHE) TRINUCLEOTIDE DISEASES (MALATTIE DA TRINUCLEOTIDI) TRIPLET REPEAT DISEASES (MALATTIE DA TRIPLETTE) UNSTABLE MUTATIONS (MUTAZIONI INSTABILI)

57 Gli alleli degli ammalati hanno una espansione di un repeat Allele normale (sano) NNNNNNNNNNNNNNNNNACTAAAAAATACAAAAAAAAAAAAAA AaAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAAaTAAAGaAAA GTtAGCCGGGCGTGGTgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN Allele espanso (malato) NNNNNNNNNNNNNNNNNACTAAAAAATACAAAAAAAAAAAAA AAaAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA GAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAG AAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGA AGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA GAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAAaTAAAGa AAAGTtAGCCGGGCGTGGTgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

58 Classificazione delle mutazioni: mutazioni da repeat Per tipo di localizzazione sul gene Mutazioni nelle regioni codogeniche Mutazioni nelle regioni regolatrici prossimali Mutazioni nelle regioni regolatrici distali Mutazioni nei siti di splicing Mutazioni negli introni Mutazioni nel sito di poliadenilazione Mutazioni nel CAP site Per tipo di variazione del DNA Mutazioni puntiformi (sostituzione di una singola coppia di basi) Piccole delezioni Piccole inserzioni Grandi delezioni Grandi inserzioni Ripetizioni Inversioni e riarrangiamenti complessi

59 Diverse espansioni di repeat

60 Grosse variazioni Grosse delezioni, duplicazioni, inserzioni e riarrangiamenti complessi

62 Delezioni nei geni della globina

63 Ricombinazione Ricombinazione: Rottura di una molecola a doppia elica del DNA (cromatide) su ognuno dei due cromosomi con conseguente ricongiunzione dei due frammenti Ricombinazione omologa: Ricombinazione tra cromosomi omologhi che avviene in meiosi o mitosi coinvolgendo sequenze identiche o molto simili. Ricombinazione omologa "equal": Normalmente coinvolge il taglio e la ricongiunzione del DNA nella stessa precisa posizione. Poiché non vi è alcuna perdita di DNA, questo meccanismo è stato implicato nella formazione di nuovi alleli. Ricombinazione omologa "unequal": Coinvolge il taglio e la ricongiunzione del DNA in sequenze omologhe ma non esattamente uguali. Questo produce cromosomi duplicati da un lato e deleti dall'altro. Ricombinazione non omologa (illegittima): Ricombinazione che avviene tra siti con minima omologia di sequenza

64 Condizioni favorevoli alla ricombinazione omologa unequal Presenza, su di un cromosoma, di sequenze simili Cluster di geni Sequenze ripetute

65 Unequal crossover

66 Hb Lepore e antilepore

67 Inserzioni Retrotrasposizione di sequenze ripetute

68 Nomenclatura delle mutazioni Nomenclature for the description of sequence variations J.T. den Dunnen, S.E. Antonarakis: Hum Genet 109(1): , 2001

69 Problemi Una variazione si può indicare in vari modi: sul DNA, sull mrna o, eventualmente sulla proteina Non esiste ancora una numerazione univoca per tutte le sequenze

70 Norme generali Preferire la dizione variazione di sequenza al posto di mutazione o polimorfismo (che hanno diversi sensi in diverse discipline) Possibile usare la numerazione sul DNA genomico (premettere la lettera g.), sul cdna (mrna) (premettere la lettera c.) o sulla proteina (premettere la lettera p.) Eventualmente segnalare la sequenza di riferimento usata per la numerazione

71 Sostituzioni di nucleotidi Le sostituzioni sono indicate dal simbolo >, con la posizione del nucleotide. Per esempio: g.89t>g indica che il nucleotide T in posizione 89 è stato sostituito dal nucleotide G (sequenza riferimento genomica) c.134a>c indica che il nucleotide A in posizione 134 è stato sostituito dal nucleotide C (sequenza riferimento cdna)

72 Delezioni Le delezioni sono indicate col simbolo del dopo i nucleotidi fiancheggianti la delezione. Per esempio: g.76_78del (o alternativamente g. 76_78delACT) indica una delezione ACT dal nucleotide 76 al 78

73 Inserzioni Le inserzioni sono indicate col simbolo ins dopo i nucleotidi fiancheggianti il sito di inserzione, seguito dalla sequenza inserita. Per esempio: g.83_84instg indica l inserzione di un dinucleotide TG tra il nucleotide 83 e 84 (genomico) c.76_77inst indica l inserzione di un nucleotide T tra i nucleotidi 76 e 77 (cdna)

74 Inserzioni/delezioni (indels) Sono descritte come una delezione seguita da una inserzione dopo il nucleotide coinvolto. Per esempio: g.112_117delinstg (alternativamente g. 112_117delAGGTCAinsTG o g. 112_117>TG) indica la sostituzione dei nucleotidi da 112 a 117 (AGGTCA) con TG

75 Duplicazioni Le duplicazioni sono indicate col simbolo dup dopo i nucleotidi fiancheggianti il sito di duplicazione. Per esempio: g.77_79dupctg indica la duplicazione delle sequenza CTG in posizione

76 Inversioni Le inversioni sono indicate col simbolo inv dopo i nucleotidi fiancheggianti il sito di inversione. Per esempio: c.203_506inv (o 203_506inv304) indica che 304 nucleotidi tra il nucleotide 203 e quello 506 sono stati invertiti

77 Sostituzioni amminoacidiche Missenso: p.trp26cys indica che l amminoacido 26 (Triptofano, Trp) è stato sostituito da una Cisteina (Cys) Nonsenso p.trp26x indica che l amminoacido 26 (Triptofano, Trp) è stato sostituito da un codone di stop (X) Frameshift p.arg97profsx23 (alternativamente p.arg97fs) indica una mutazione frameshift con l Arginina 97 come primo amminoacido coinvolto (cambiato in Prolina) e una nuova reading frame aperta per 23 amminoacidi

78 Per studiare Cummings Cap 11