ε (M -1 cm -1 ) Composto 260 nm 340 nm NAD ~ 0 NADPH

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1 1 Una soluzione contenente una miscela di NADPH e NAD + viene analizzata spettrofotometricamente. L assorbanza di tale miscela, misurata in una cuvetta da 1 cm di lunghezza, è pari a: A260 nm = 0,85 A340nm = 0,11 Calcolare la concentrazione di NADPH e NAD + contenuti nella miscela e, sapendo il peso molecolare delle due sostanze (PMnad+ = g/mol, PMnadph = g/mol), la quantità in microgrammi presenti nella soluzione di partenza, il cui volume totale era pari a 58 ml. I coefficienti di estinzione del NADPH e del NAD + alle lunghezze d onda sopra riportate sono i seguenti: 2 ε (M -1 cm -1 ) Composto 260 nm 340 nm NAD ~ 0 NADPH Analizzare i seguenti dati di cinetica enzimatica (vedi tabella sottostante), utilizzando il sia il grafico delle iperboli che il grafico dei doppi reciproci. Le velocità iniziali 2 sono state misurare in presenza di un sostanza aggiunta nel saggio enzimatico alla concentrazione di 50 µm. Quale fenomeno stiamo osservando in presenza di tale sostanza? Dal grafico dei doppi reciproci misurate sperimentalmente le costanti cinetiche apparenti (Km e Vmax) e discutete i risultati. Concentrazione di substrato [S] Velocità iniziale 1 (Vi) Velocità iniziale 2 (Vi) 1/[S] 1/[Vi]1 1/[Vi]2 (M 10-3 ) (mmoli L -1 min -1 ) (mmoli L -1 min -1 ) 0,020 0,157 0,066 0,035 0,201 0,095 0,050 0,232 0,125 0,100 0,275 0,182 0,300 0,334 0,267 Calcolare inoltre la kcat, sapendo che: - la concentrazione dell enzima purificato è stata calcolata spettrofotometricamente. Lo spettro relativo (vedi figura sotto) si riferisce a 50 µl di enzima in 1 ml di volume finale, in una cuvetta da 1 cm. - il coefficiente di estinzione molare dell enzima a 280 nm è pari a M -1 cm -1.

2 - in ogni saggio enzimatico sono stati utilizzati 5 µl di una soluzione diluita 250 volte di enzima, in un volume finale di 600 µl in cuvetta Lunghezze d'onda (nm) In Allegato 1 è fornita la mappa del cdna (più regioni fiancheggianti) codificante per la treonina sintasi di Escherichia coli, che avete a disposizione in una provetta da qualche parte in fondo al freezer. La struttura primaria della proteina è la seguente: 1 MKLYNLKDHNEQVSFAQAVTQGLGKNQGLFFPHDLPEFSLTEIDEMLKLDFVTRSAKILSAFIGDEIPQEILEERVRAAFA FPAPVANVESDVGCLELFHGPTLAFKDFGGRFMAQMLTHIAGDKPVTILTATSGDTGAAVAHAFYGLPNVKVVILYPRGKI SPLQEKLFCTLGGNIETVAIDGDFDACQALVKQAFDDEELKVALGLNSANSINISRLLAQICYYFEAVAQLPQEARNQLVV SVPSGNFGDLTAGLLAKSLGLPVKRFIAATNVNDTVPRFLHDGQWSPKATQATLSNAMDVSQPNNWPRVEELFRRKIWQLK ELGYAAVDDETTQQTMRELKELGYTSEPHAAVAYRALRDQLNPGEYGLFLGTAHPAKFKESVEAILGETLDLPKELAERAD LPLLSHNLPADFAALRKLMMNHQ 428 Evidenziate sulla mappa in allegato il codone di inizio della regione codificante e il codone di stop. Verificate di trovarvi nella regione codificante traducendo i primi 5 codoni e gli ultimi 5, utilizzando il codon usage (Allegato 2). Disegnate degli oligonucleotidi (della lunghezza di nucleotidi) che servano da primer per una reazione di PCR per l amplificazione del cdna della treonina sintasi, in modo da poter poi clonare tale cdna dentro al plasmide pet22b(+) (mappa in Allegato 3), tra i siti di restrizione NdeI e EcoRI. È possibile utilizzare questi due enzimi di restrizione per il clonaggio? Altrimenti utilizzate XhoI come sito di clonaggio a valle. Clonate tutta la sequenza della treonina sintasi, comprendendo sia la metionina iniziale che il codone di stop. Il punto isoelettrico della treonina sintasi è pari a Se per la purificazione della proteina voleste utilizzare una resina a scambio ionico, facendo in modo che la proteina si attacchi alla resina in un tampone 20 mm potassio fosfato ph 7.2, che resina a scambio ionico scegliereste: una CM-sephadex (carbossimetil-sephadex, scambio cationico) o una DEAEsepharosio (dietilamminetil-sepharosio, scambio anionico)? Che tampone utilizzereste per eluire poi la proteina dalla resina?

3 4 Una soluzione contiene una miscela di NADH e ATP vengono analizzati spettrofotometricamente. L assorbanza di tale miscela, misurata in una cuvetta da 1 cm di lunghezza, è pari a: A260 nm = 0,89 A340nm = 0,12 Calcolare la concentrazione di NADPH e ATP contenuti nella miscela, e sapendo il peso molecolare delle due sostanze (PMatp = g/mol, PMnadph = g/mol), la quantità in microgrammi presenti nella soluzione di partenza, il cui volume totale era pari a 36 ml. I coefficienti di estinzione del NADPH e dell ATP alle lunghezze d onda sopra riportate sono i seguenti: εmol (M -1 cm -1 ) Composto 260 nm 340 nm ATP ~ 0 NADH L Aspartato aminotransferasi da fegato eluisce da una cromatografia Biogel P-300 (gelfiltrazione) a una posizione corrispondente al peso molecolare di 90 kda. La stessa proteina, sottoposta a elettroforesi in presenza di SDS, mostra un peso molecolare di 45 kda. Un saggio su un campione di aspartato aminotrasferasi mostra la presenza di 5,43 µg di piridossale 5 -fosfato (PM = 247,1) per milligrammo di proteina. Che conclusioni si possono trarre sulla struttura dell aspartato aminotransferasi? 6 Il tessuto epatico embrionale contiene un enzima che catalizza la reazione S èp. Anche il tessuto epatico adulto mostra tale attività enzimatica. Analizzare i dati di attività enzimatica relativi ai due enzimi (vedi tabella sottostante), utilizzando sia il grafico Vi vs [S] che il grafico dei doppi reciproci. Determinare, dal grafico dei doppi reciproci, la Km e la Vmax). Che differenza c è fra l enzima embrionale e quello adulto? Concentrazione iniziale di substrato [S] (M 10-4 ) Enzima adulto Velocità iniziale (Vi) (µmoli L -1 min -1 ) Enzima embrionale 0,16 1,05 5,00 0,25 1,54 6,66 0,33 1,98 8,00 0,5 2,86 10,00 0,7 3,78 11,67 1 5,00 13,33

4 1,5 6,67 15,0 1,67 7,15 15,4 2,0 8,00 16,0 3,0 10,00 17,1 Inoltre, calcolare la kcat, sapendo che: - la concentrazione degli enzimi purificati è stata calcolata spettrofotometricamente. Gli spettri relativi (vedi figure sotto) si riferiscono a 15 µl di enzima in 1 ml di volume finale, in una cuvetta da 1 cm. - il coefficiente di estinzione molare dell enzima adulto a 280 nm è pari a M -1 cm -1, mentre quello dell enzima embrionale è pari a M -1 cm in ogni saggio enzimatico sono stati utilizzati 3 µl di una soluzione diluita 50 volte di enzima, in un volume finale di 600 µl in cuvetta. Enzima adulto Lunghezza d'onda (nm) Enzima embrionale Lunghezza d'onda (nm)

5 7 Dieci grammi di burro sono stati saponificati; la frazione non saponificabile è stata estratta in 50 ml di cloroformio. L assorbanza di tale frazione, misurata in una cuvetta da 1 cm di lunghezza, è pari a: A328 nm = 0,27 A458nm = 0,24 Calcolare la quantità di carotene e vitamina A contenuti nel panetto originario di burro (in µg di sostanza per grammo di burro). I coefficienti di estinzione del carotene e della vitamina A alle lunghezze d onda sopra riportate sono i seguenti: a1% in CHCl3 Composto 328 nm 458 nm Carotene Vitamina A 1550 ~ 0 8 La glicogeno fosforilasi da muscolo eluisce da una cromatografia Biogel P-300 (cromatografia per gel-filtrazione) a una posizione corrispondente al peso molecolare di 360 kda. La stessa proteina, sottoposta a elettroforesi in presenza di SDS, mostra un peso molecolare di 90 kda. Un saggio su un campione della glicogeno fosforilasi mostra la presenza di 2,75 µg di piridossale (PM = 247,1) per milligrammo di proteina. Che conclusioni si possono trarre sulla struttura della glicogeno fosforilasi? 9 Analizzare i seguenti dati di cinetica enzimatica (vedi tabella sottostante), utilizzando il grafico dei doppi reciproci. Quale inaspettato fenomeno stiamo osservando? È possibile stimare le costanti cinetiche (Km e Vmax)? Concentrazione iniziale di substrato [S] Velocità Iniziale (Vi) 1/[S] 1/[Vi] (M 10-3 ) (µmoli L -1 min -1 ) 0,6 13,26 1,3 24,50 2,5 37,45 5,0 51,15 10,0 48,08 20,0 40,50

6 40,0 33,08 Dopo aver stimato la Vmax, calcolare la kcat, sapendo che: - la concentrazione dell enzima purificato è stata calcolata spettrofotometricamente. Lo spettro relativo (vedi figura sotto) si riferisce a 25 µl di enzima in 800 µl di volume finale, in una cuvetta da 1 cm. - il coefficiente di estinzione molare dell enzima a 280 nm è pari a M -1 cm in ogni saggio enzimatico sono stati utilizzati 5 µl di una soluzione diluita 150 volte di enzima, in un volume finale di 1000 µl in cuvetta. 10 In Allegato 4 è fornita la mappa del cdna (più regioni fiancheggianti) codificante per la piridossal kinasi umana (hplk), che avete a disposizione in una provetta da qualche parte in fondo al freezer. La struttura primaria della proteina è la seguente: 1 MEEECRVLSIQSHVIRGYVGNRAATFPLQVLGFEIDAVNSVQFSNHTGYAHWKGQVLNSDELQELYEGLR LNNMNKYDYVLTGYTRDKSFLAMVVDIVQELKQQNPRLVYVCDPVLGDKWDGEGSMYVPEDLLPVYKEKV VPLADIITPNQFEAELLSGRKIHSQEEALRVMDMLHSMGPDTVVITSSDLPSPQGSNYLIVLGSQRRRNP AGSVVMERIRMDIRKVDAVFVGTGDLFAAMLLAWTHKHPNNLKVACEKTVSTLHHVLQRTIQCAKAQAGE GVRPSPMQLELRMVQSKRDIEDPEIVVQATVL 312 Evidenziate sulla mappa in allegato il codone di inizio della regione codificante (è il primo ATG che incontrate) e il codone di stop. Verificate di trovarvi nella regione codificante traducendo i primi 5 codoni e gli ultimi 5, utilizzando il codon usage (Allegato 2). Vogliamo inserire il cdna codificante per la hplk nel vettore pet22 (mappa in Allegato 3), tra i siti di restrizione NdeI e EcoRI. È una scelta opportuna o bisogna scegliere altri enzimi di restrizione? Per prima cosa bisogna amplificare il cdna, inserendo alle estremità i siti di restrizione adeguati. Disegnare gli oligonucleotidi (20-30 nucleotidi di lunghezza) da utilizzare come primer per la reazione di PCR. Disegnate due coppie di primer, una per eliminare la coda di poli-his al C-terminale della proteina, e l altra per mantenere la coda di istidine. Attenzione a non andare fuori frame.

7 11 Analizzare i seguenti dati di cinetica enzimatica (vedi tabella sottostante), utilizzando il grafico Vi vs [S]. Determinare se l enzima obbedisce a una cinetica iperbolica o sigmoidale, magari ingrandendo la parte iniziale del grafico. Stimare le costanti cinetiche (Km o [S]0,5* e Vmax). * La [S]0.5 equivale alla Km per un enzima che mostra cooperatività (andamento sigmoide della curva). Concentrazione iniziale di substrato [S] Velocità Iniziale (Vi) (M 10-4 ) (µmoli L -1 min -1 ) 6,25 1,54 12,5 5,88 25,0 20,0 50,0 50,0 100,0 80,0 200,0 94,12 400,0 98,46 800,0 99,61 Inoltre, calcolare la kcat, sapendo che: - la concentrazione dell enzima purificato è stata calcolata spettrofotometricamente. Lo spettro relativo (vedi figura sotto) si riferisce a 50 µl di enzima in 800 µl di volume finale, in una cuvetta da 1 cm. - il coefficiente di estinzione molare dell enzima a 280 nm è pari a M -1 cm in ogni saggio enzimatico sono stati utilizzati 2 µl di una soluzione diluita 25 volte di enzima, in un volume finale di 600 µl in cuvetta Lunghezze d'onda (nm)

8 12 Cercate in banca dati (PubMed Nucleotide) la sequenza del cdna codificante per la homoserine kinase di Escherichia coli. Si tratta dell enzima con protein_id=aan " in PubMed Protein. Mappate la sequenza di cdna utilizzando Webcutter2 e controllate che codifichi effettivamente per la homoserine kinase (utilizzando il codon usage di E. coli, Allegato 2). Che reazione catalizza l enzima? Scrivete le strutture di substrati e prodotti. Qual è l E.C. number dell enizma? Di che via biosintetica fa parte? Disegnate degli oligonucleotidi che servano da primer per una reazione di PCR per l amplificazione del cdna della homoserine kinase, in modo da poter poi clonare tale cdna dentro al plasmide pet22b(+) (Allegato 3), tra i siti di restrizione NdeI e XhoI. È possibile utilizzare questi due enzimi di restrizione per il clonaggio? Ipotizzate due diversi clonaggi. Nel primo dovrete aggiungere alla homoserine kinasi, in posizione C-terminale, la coda di istidine presente nel plasmide. Nel secondo clonaggio invece dovete fare in modo che la coda di istidine non venga tradotta. 13 La serina idrossimetiltransferasi umana eluisce da una cromatografia Biogel P-300 a una posizione corrispondente al peso molecolare di kda. La stessa proteina, sottoposta a elettroforesi in presenza di SDS, mostra un peso molecolare di circa 53 kda. Un saggio su un campione di serina idrossimetiltrasferasi mostra la presenza di 3,85 µg di piridossale 5 -fosfato (PM = 247,1) per milligrammo di proteina. Che conclusioni si possono trarre sulla struttura della serina idrossimetiltrasferasi? discutete la stechiometria del piridossale 5 -fosfato: che cosa potrebbe essere successo durante l analisi?