LA REGOLAZIONE DELL ESPRESSIONE GENICA PUÒ AVVENIRE A DIVERSI LIVELLI:

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1 LA REGOLAZIONE DELL ESPRESSIONE GENICA PUÒ AVVENIRE A DIVERSI LIVELLI: 1. A livello di cromatina Metilazione del DNA Modificazioni degli istoni 2. A livello di trascrizione Fatt. di trascr. Regolatori Splicing alternativo 3. A livello post trascrizione RNA silencing 4. A livello post traduzione Ubiquitinazione e degradazione delle proteine

2 1. REGOLAZIONE DELL ESPRESSIONE GENICA A LIVELLO DI CROMATINA 1a: METILAZIONE DEL DNA Le basi del DNA possono essere metilate per azione della DNA metilasi con formazione della 5-metilcitosina

3 1b : MODIFICAZIONI DEGLI ISTONI Acetilazione e deacetilazione istoni Fosforilazione e defosforilazione degli istoni Metilazione e demetilazione degli istoni Sono modificazioni chimiche che avvengono preferenzialmente sugli amminoacidi LISINA e SERINA e ARGININA Influenzano la attività del DNA associato agli istoni

4 LE ESTREMITA N-TERMINALI DEGLI ISTONI HANNO MOLTI SITI DI MODIFICAZIONE

5 LE MODIFICAZIONI DEGLI ISTONI CONTROLLANO L ATTIVITA DEI GENI L acetilazione degli istoni favorisce la trascrizione La metilazione degli istoni reprime la attività dei geni

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7 L ESTREMITA N-TERMINALE DELL ISTONE H3 PU0 TROVARSI IN STATI ALTERNATIVI I siti bersaglio sono la lisina in posizione 9 e la serina in posizione 10 Cromatina Attiva Cromatina Inattiva

8 2. REGOLAZIONE DELL ESPRESSIONE GENICA A LIVELLO DELLA TRASCRIZIONE 2a regolazione della trascrizione svolta dai Fattori di Trascrizione Regolatori può portare alla attivazione o alla repressione del gene

9 FATTORI DI TRASCRIZIONE REGOLATORI e FATTORI DI TRASCRIZIONE BASALE

10 MOTIVI SRTUTTURALI DEI DIVERSI TIPI DI FATTORI DI TRASCRIZIONE REGOLATORI I fattori di trascrizione regolatori sono proteine classificate in base alla struttura Zinc Finger (struttura a dita di Zn) Helix-turn-helix (Struttura a elicaripiegamento-elica) Leucin zipper (struttura a cerniera di leucina che facilita la formazione di dimeri) Helix-loop-helix (struttura a elica-ansa-elica che facilita la formazione di dimeri)

11 I FATTORI DI TRASCRIZIONE REGOLATORI SONO PROTEINE CAPACI DI LEGARSI AL DNA Hanno un dominio che può legarsi alla doppia elica di DNA Hanno anche un dominio capace di interagire con i Fattori basali della trascrizione o con la RNApolII o con altri FT (o con molecole effettrici come gli ormoni)

12 FATTORI DI TRASCRIZIONE REGOLATORI CHE SI LEGANO AGLI ENHANCER E AI SILENCER Esercitano una azione continuativa sulla trascrizione Gli attivatori si legano agli Enhancer e i repressori si legano ai silencer interferendo con l azione degli attivatori In genere agiscono nella regolazione tessuto-specifica TFIID, B, A, F, E e H sono i fattori basali della trascrizione

13 FATTORI DI TRASCRIZIONE REGOLATORI CHE SI LEGANO A SPECIFICHE SEQUENZE DI REGOLAZIONE DEL PROMOTORE Agiscono in modo transiente per il tempo necessario alla risposta della pianta Esempio. alcuni fattori di trascrizione rispondono agli stimoli esterni come disidratazione e interni come ABA Struttura di un promotore a monte di un gene codificante una deidrina di girasole.

14 PROMOTORE DI UN GENE CHE CODIFICA UNA METALLOTIONEINA

15 Schematic illustration of the cold response network in Arabidopsis. MYBRS = MYB recognition sequence MYCRS= MYC recognition sequence HOS1= ubiquitin E3 ligase

16 2. REGOLAZIONE DELL ESPRESSIONE GENICA A LIVELLO DELLA TRASCRIZIONE 2b SPLICING ALTERNATIVO

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18 4. REGOLAZIONE DELL ESPRESSIONE GENICA A LIVELLO POST TRADUZIONE UBIQUITINAZIONE E DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE IL PROCESSO DI UBIQUITINAZIONE Sono necessari 4 enzimi : E1, E2, E3 e E4 E1, Ubiquitin activating enzyme E2, Ubiquitin conjugating enzyme E3, Ubiquitin ligase E4, Ubiquitin chain factor

19 DEGRADAZIONE DELLA PROTEINA UBIQUITINATA I proteosomi sono grandi complessi proteici presenti in tutti gli eucarioti e in alcuni batteri la cui funzione è quella di degradare le proteine non più necessarie o danneggiate

20 3. REGOLAZIONE DELL ESPRESSIONE GENICA A LIVELLO POST-TRASCRIZIONALE RNA INTERFERENCE Esperimenti precedenti Jorgensen e coll in Petunia (1990): trasformazione con un gene per la pigmentazione viola anziché ottenere fiori viola ottennero fiori bianchi (o al max variegati). Spiegarono il risultato con la CO-soppressione : sia il gene endogeno che il transgene venivano soppressi In Neurospora è stato osservato un fenomeno simile alla co-soppressione detto Quelling L RNA interference è stato scoperto in Caenorabditis elegans (1998) facendo esperimenti con RNA antisenso per bloccare un certo gene. Videro che il gene veniva bloccato anche dall RNA senso di controllo. Se iniettavano un RNA ibrido senso-antisenso ottenevano un forte silenziamento del gene endogeno Studi successivi hanno studiato in dettaglio il Silenziamento genico post-trascrizionale mediato dai piccoli RNA non codificanti. E stato scoperto The small RNAs world

21 RNA SILENCING FILMATO C. C. Mello e A. Fire hanno vinto il Premio Nobel nel 2006 per la scoperta dell RNA Interference o silencing (1998 Nature) La regolazione della trascrizione avviene anche degradando gli RNA già prodotti E un meccanismo di regolazione dell espressione genica Post-trascrizionale Si basa sulla produzione di microrna, mi RNA, e di short interfering RNA, i sirna piccoli RNA non codificanti complementari all RNA trascritto da silenziare I piccoli RNA non codificanti sono RNA di nucleotidi che sono stati identificati in quasi tutti gli eucarioti, nelle piante identificati per la prima volta nel 2002 Nelle piante l RNA silencing ha un ruolo di difesa dai virus patogeni ed è anche un metodo per silenziare geni specifici

22 I micro RNA (mirna) SONO CODIFICATI DA GENI DETTI GENI mirna Negli Animali L RNA trscritto dai geni mirna forma una struttura a doppio filamento imperfetto che viene processata da un enzima detto DROSHA (RNAsi II) nel nucleo Il pre mirna viene riconosciuto dal DICER e tagliato: si forma un mirna a doppio filamento di 21bp che si lega ad un complesso di proteine, così si forma il RISC (RNA Induced Silencing Complex) Il complesso mirna-risc apre il doppio filamento e uno solo dei due filamenti rimane con il RISC Il mirna-risc forma un ibrido con l RNA messaggero nella regione 3 UTR e ne inibisce la traduzione Oppure taglia l RNA messaggero da silenziare I bersagli dei mi RNA sono mrna prodotti da vari geni

23 I sirna negli animali sirna Si formano a partire da lunghe molecole di RNA a doppio filamento di diversa origine. DICER RISC, RISC-si RNA che può tagliare gli mrna complementari o bloccarne la traduzione come i mirna. Si ritiene che prima si sia evoluto il sistema dei sirna per difesa dai virus (e dai trasposoni) poi il sistema dei microrna per regolare la espressione genica di specifici geni

24 I microrna DELLE PIANTE Anche nelle piante sono codificati dai geni mirna Si trascive un mirna precursore che forma una struttura secondaria stemloop che poi viene processata per ottenere il mirna maturo ( sequenza in grassetto) In Arabidopsis sono stati trovati 117 geni mirna In vite 140 organizzati in 28 famiglie

25 I microrna DELLE PIANTE Distribuzione dei geni mirna in diverse specie mirna families mirna genes Arabidopsis thaliana Oryza sativa Populus trichocarpa Zea mays Sorghum bicolor Glycine max Medicago truncatula Saccharum officinarum 6 16 Molti geni mirna diversi possono codificare lo stesso mirna maturo. Questi geni son raggruppati in famiglie. (Griffiths-Jones et al.,2006) I mirna sono coinvolti nei processi dello sviluppo della pianta, nella organogenesi, nella risposta della pianta a stress ambientali e stress da patogeni, nella risposta a ormoni...

26 I microrna DELLE PIANTE Biogenesi e meccanismo di azione I geni mirna sono trascritti dalla RNApol II. La struttura secondaria dell RNA viene processata da una proteina tipo DICER (DCL 1) in più passaggi fino alla produzione di duplex mirna-mirna* Il duplex mirna-mirna passa nel citoplasma Il duplex si apre e il mirna siassocia al RISC. Si forma il coplesso mirna-risc che taglia l mrna o ne impedisce la traduzione.

27 I sirna nelle PIANTE 1. I sirna che derivano da RNA trascritti da transgeni o da virus patogeni Gli RNA trascritti da virus o dai transgeni vengono resi a doppio filamento da RDR1/6 RNA Dependent RNApolimerasi 1/6 I lunghi RNA a doppio filamento (in blu) sono tagliati in corti filamenti di 21 nucleotidi (in rosso) da enzimi DICER- like. a VIA a: i piccoli si RNA sono caricati dal RISC (associati con AGO4) Il complesso si lega allo stesso RNA da cui si è originato, lo taglia quindi lo silenzia. b

28 I sirna nelle PIANTE 2. I si RNA che derivano da Elementi Trasponibili e da Sequenze Eterocromatiche Alcuni Autori li chiamano heterochromatic si RNA hc-sirna DNA Biogenesi dei hc-si RNA RISC RNApol IV RNA RDR Bioge nesi dei hc-si RNA Dicer-like Elementi Trasponibili RISC Dicer-like

29 I sirna prodotti possono seguire due vie: 1 via La via del silenziamento degli mrna prodotti dai trasposoni stessi per bloccarli 2 via La via del rimodellamento della cromatina attraverso: la metilazione degli istoni H3K4 e H3K9 (Istone H3, lisina in posizione 9 e 4) la metilazione del DNA, detta metilazione del DNA dipendente da RNA RISC 1 via 2 via Dicer-like RISC Elementi Trasponibili

30 FINE