Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici

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1 Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici 1. L Analisi di restrizione di frammenti o RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) di DNA comporta lo studio delle dimensioni dei frammenti di DNA prodotti da diversi enzimi di restrizione usati singolarmente e in combinazione con la possibilità di costruire una mappa dell acido nucleico analizzato. 2. Analisi di restrizione di frammenti di DNA + marcatura con sonde geniche specifiche: Southern blot Nothern blot Dot blot

2 IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI Ibridazione: appaiamento di 2 molecole di DNA o RNA complementari Complementarieta : una sequenza nucleotidica S e la complementare di S se i due filamenti possono appaiarsi secondo la regola di Watson e Crick

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4 L ibridazione degli acidi nucleici ne richiede prima la denaturazione Condizioni che possono destabilizzare la doppia elica provocando la separazione delle due catene (denaturazione): Alte temperature ph alcalino estremo (>13) Bassa forza ionica [Na + ] Presenza in soluzione di sostanze che rompono i ponti a idrogeno (urea, formammide).

5 Tm La Tm (temperatura di fusione o melting T) caratterizza la stabilita dell ibrido che si forma tra la sonda e il suo filamento complementare. La Tm e critica per determinare la temperatura ottimale per usare sonde oligonucleotidiche come sonde per ibridizzare o come inneschi per la reazione di PCR, o sonde non perfettamente complementari. La Tm dipende da: Lunghezza della sonda Composizione in basi (G+C e A+T) Grado di omologia Ambiente chimico: Concentrazione salina (i cationi monovalenti come ioni Na + stabilizzano la doppia elica, i denaturanti chimici come formamide o urea la destabilizzano)

6 Tm (temperatura di fusione): temperatura alla quale il 50% di una certa sequenza nucleotidica e ibridizzata al suo filamento complementare. La Tm dipende da: Lunghezza della sonda Composizione in basi (% di G+C)

7 La discesa graduale della temperatura e la permanenza delle molecole per un certo tempo pochi gradi al di sotto della temperatura di denaturazione sono fondamentali affinchè ci possa essere ibridazione, processo dipendente dai moti di agitazione termica. Se dopo la denaturazione la soluzione viene portata a bassa temperatura non si ha ibridazione, ma stabilizzazione della struttura secondaria delle singole catene. Per mezzo dell ibridazione si possono formare delle doppie eliche di DNA-DNA, DNA-RNA o RNA-RNA. La condizione fondamentale perché ciò avvenga è che in soluzione si mettano molecole con sequenza complementare (antiparallele). L ibridazione è una forma di riconoscimento molecolare estremamente specifica.

8 La denaturazione non è un processo irreversibile. Infatti se dopo la separazione delle eliche si fa scendere gradualmente la temperatura, le singole eliche complementari si possono riappaiare e la doppia elica può riformarsi. Questo processo si chiama ibridazione.

9 Diminuzione della viscosità Aumento di assorbanza a 260nm La denaturazione della doppia elica si accompagna a grosse variazioni delle proprietà fisiche delle soluzioni di DNA

10 STRINGENZA Condizioni di ibridazione piu stringenti (richiedono maggiore percentuale di omologia tra sonda e bersaglio): maggiore Temperatura minore [ ] salina presenza di denaturanti chimici Condizioni di ibridazione meno stringenti (permettono minore percentuale di omologia tra sonda e bersaglio): minore Temperatura maggiore [ ] salina assenza di denaturanti chimici

11 In condizioni opportune di temperatura e forza ionica (stringenza) si possono ottenere anche delle eliche in cui sono tollerati degli appaiamenti non perfetti

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13 Progettazione e produzione di sonde geniche L IMPIEGO DI SONDE BASATE SU ACIDI NUCLEICI E UNO STRUMENTO FONDAMENTALE PER LA GENETICA MOLECOLARE SI SFRUTTA LA CAPACITA DELLE MOLECOLE DI ACIDO NUCLEICO A SINGOLO FILAMENTO DI FORMARE MOLECOLE A DOPPIO FILAMENTO IBRIDAZIONE

14 SAGGI DI IBRIDAZIONE STANDARD E SAGGI INVERSI STANDARD DOT-BLOT SOUTHERN BLOT NORTHERN BLOT IBRIDAZIONE IN SITU SU TESSUTO O CROMOSOMI INVERSI (MARCATURA DEL TARGET) MICROARRAY

15 Saggi di ibridazione standard e inversa STANDARD: bersaglio non marcato legato a supporto solido, sonda marcata in soluzione Northern blot, slot blot Ibridazione in situ su tessuto o su cromosomi INVERSA: sonda non marcata legata a supporto solido, bersaglio marcato in soluzione Microarray o macroarray di DNA Microarray di oligonucleotidi

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17 Metodi di marcatura degli acidi nucleici

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19 Sintesi chimica oligonucleotidi: Con questo sistema si possono sintetizzare in vitro singoli filamenti di DNA di grandezza compresa tra 6 e 100 nucleotidi

20 Le DNA polimerasi batteriche possono essere purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro datp dctp dgtp dttp Primer sintetico DNA stampo (singolo filamento) DNA polimerasi

21 Le DNA polimerasi batteriche possono essere purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro DNA polimerasi DNA stampo (singolo filamento)

22 Le DNA polimerasi batteriche possono essere purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro Se nel corso della sintesi vengono incorporati nucleotidi MARCATI (radioattivi, fluorescenti) allora il filamento di nuova sintesi sara MARCATO

23 Utilizzando una RNA polimerasi invece di una DNA polimerasi potro generare delle sonde di RNAantisenso marcate RNA polimerasi crna Nucleotidi marcati

24 Traccianti utilizzati Nucleotidi marcati con isotopi radioattivi

25 Traccianti utilizzati: Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive - Fluorocromi (marcatura diretta) -Digossigenina (riconosciuta da anticorpi specifici marcati con fluorocromi o enzimi) - Biotina (riconosciuta da avidina marcata con fluorocromi o enzimi)

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27 Traccianti utilizzati Fluorocromi

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29 Traccianti utilizzati Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive: digossigenina

30 trasferimento dopo frazionamento elettroforetico: DNA: Southern blot RNA: Northern blot

31 Cella elettroforetica per gel di agarosio

32 Separazione di frammenti di DNA (o RNA) di diversa lunghezza tramite elettroforesi Incubare con colorante fluorescente (bromuro d etidio) Bande corrispondenti al DNA

33 Trasferimento di DNA-RNA su filtro dopo frazionamento elettroforetico

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36 Trasferimento di RNA (Northern blot) Estrazione dell RNA Separazione tramite elettroforesi su gel denaturante Trasferimento su membrana Promozione di legame covalente con la membrana (cross-linking) Ibridazione con sonda specifica Visualizzazione del segnale (autoradiografia o colorimetria) Gel colorato con etidio bromuro 28S rrna 18S rrna

37 SLOT o DOT-BLOT GOCCIA DI DNA CROMOSOMICO SU FILTRO DI NYLON O NITROCELLULOSA >SONDA MARCATA A B C D (sia con campioni di RNA che di DNA)

38 Ibridazione su membrana DNA a doppio filamento fusione Il DNA si lega sul filtro DNA a singolo filamento filtro Incubare con sonda marcata Lavare via il DNA marcato non ibridizzato autoradiografia

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40 Ibridazione in situ Questa metodica si basa sull ibridazione di sonde marcate direttamente su cellule o tessuti. Si può ibridare su sezioni istologiche o su materiale non sezionato (in quest ultimo caso si parla whole-mount). E l unica tecnica che permette di localizzare l espressione di un dato mrna a livello delle singole cellule. Ideale per studiare i geni espressi in un gruppo ristretto di cellule all interno di un tessuto, o i geni la cui espressione è modulata nel tempo e nello spazio (estremamente utilizzata negli studi di biologia dello sviluppo).

41 Schema ibridazione in situ su sezioni istologiche

42 Esempio di ibridazione: FISH (fluorescent in situ hybridization) La FISH su cromosomi metafasici utilizzando sonde specifiche per un determinato allele permette di evidenziare eventuali anormalita cariotipiche quali traslocazioni, duplicazioni o polisomie

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