Prof. R. Velotta Dr. R. Esposito

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1 Prof. R. Velotta Dr. R. Esposito

2 La fluorescenza La spettroscopia di fluorescenza è un potente strumento per lo studio delle strutture e delle dinamiche molecolari, in fisica, chimica e biologia. Sebbene la normale spettroscopia di fluorescenza a stato stazionario sia caratterizzata da un elevata sensibilità, informazioni più dettagliate sul microambiente molecolare possono essere ottenute sfruttando la dipendenza temporale del segnale di fluorescenza.

3 La fotoluminescenza è l emissione di luce da stati elettronici eccitati di una qualsiasi sostanza. La fotoluminescenza si distingue in fluorescenza o fosforescenza: Nella fluorescenza, l emissione avviene dallo stato di singoletto, nel quale l elettrone eccitato è accoppiato con spin opposto all elettrone dello stato fondamentale. Il ritorno allo stato fondamentale è una transizione permessa per spin ed avviene rapidamente con l emissione di un fotone. Il rate di emissione della fluorescenza è tipicamente di 10 8 s -1. Nella fosforescenza invece l emissione avviene dallo stato di tripletto, nel quale l elettrone ha la stessa orientazione di spin dello stato fondamentale. Le transizioni allo stato fondamentale sono proibite; pertanto il rate di emissione di fosforescenza è piuttosto lento (10 3 s -1 ).

4 I fluorofori sono le sostanze che emettono la radiazione di fluorescenza e possono essere classificati come intrinseci ed estrinseci: i fluorofori intrinseci (feninlananina, tyrosina, triptofano, fad) sono ampiamente diffusi nei tessuti biologici ed emettono fluorescenza in modo naturale. Quando la fluorescenza intrinseca non è sufficientemente intensa per la realizzazione di certi esperimenti, come ad esempio nel caso del DNA e dei lipidi, l emissione di fluorescenza viene ottenuta per mezzo dei fluorofori estrinseci (fluoresceina, rodamina etc.). Questi si accumulano prevalentemente in cellule e tessuti affetti da patologie; pertanto, in seguito all esposizione a luce di opportuna lunghezza d onda, la patologia risulterà evidenziata dalla comparsa di un segnale di fluorescenza maggiore rispetto a quello emesso dal tessuto circostante.

5 Diagramma di Jablonski La relazione tra l assorbimento di luce e l emissione di fluorescenza viene generalmente illustrata per mezzo del cosiddetto diagramma di Jablonski IC Internal conversion k i ~ s -1 ABS = assorbimento IC = conversione interna CQ= quenching collisional ISC = inter-system crossing FL = fluorescenza PH = fosforescenza IC Inter-system crossing k x ~ s -1 Fluorescence k f ~ s -1 ABS FL PH Phosphorescence k ph < 10 6 s -1 La fluorescenza è osservata se k f ~> k i + k x Il tempo speso da una molecola in uno suo stato eccitato è determinato dalla somma delle costanti cinetiche di tutti i processi di diseccitazione

6 Cosa si intende per vita media di un fluoroforo? I processi di assorbimento e di emissione sono quasi sempre studiati su popolazioni di molecole e le proprietà di un singolo membro della popolazione sono dedotte dalle proprietà mascroscopiche del processo. In generale il comportamento di una popolazione di fluorofori eccitati è descritto dalla familiare rate equation: * dn t dt ( ) = * k n t ( ) Che descrive la variazione per unità di tempo delle molecole eccitate all istante t

7 Integrando si ottiene: n * * ( t) = n (0) exp (- k t) La vita mediaτ è uguale a k -1 Se una popolazione di fluorofori è eccitata, la vita media τ è il tempo richiesto perchè il numero di molecole eccitate decada a 1/e o del 36.8% dal valore iniziale, essendo: * n ( t) n * (0) = e t / τ

8 La costante di diseccitazione k è la somma delle costanti di tutti i possibili canali di diseccitazione: k = k f +k i + k x + k ET + = k f + k nr k f è la costante di decadimento di fluorescenza, k i di decadimanto per conversione interna, k x la costante di decadimento per inter-system crossing, k ET la costante di trasferimento di energia inter-molecolare e k nr è la somma delle costanti dei decadimenti non radioativi

9 Processi non radioativi: Molecole isolate in fase gassosa subiscono solo conversione interna e inter-system crossing Nella fase condensata si aggiungono ulteriori meccanismi dovuti all interazione con il microambiente: reazioni chimiche allo stato eccitato, trasferimento di energia, Coumarine in etanolo ha una vita media di 4 ns Isoalloxazina in acqua ha una vita media di 4.5 ns La vita media del triptofano nelle proteine varia da ~0.1 ns a ~8 ns

10 La vita media radioativa τ r = k f -1 è praticamente costante per una data molecola La vita media di fluorescenza τ = k -1 = (k f + k nr ) -1 dipende dal microambiente attraverso k nr. Quantum yield di fluorescenza: È proporzionale alla vita media di fluorescenza L aggiunta di un ulteriore percorso di decadimento non radioativo aumenta k nr diminuisce τ e quindi QY. L intensità di fluorescenza I (t) = k f n*(t) è proporzionale a n*(t) e vice versa

11 Come si misura la vita media di fluorescenza? Dominio del tempo Le molecole sono eccitate da un impulso molto breve(prossimo ad una δ) all istante t = 0. Si misura l intensità del decadimento di fluorescenza solitamente tramite un sistema Time Correlated Single Photon Counting (TCSPC) I(t) = α exp (- t / τ) Il decadimento di fluorescenza reale è una convoluzione con il profilo dell impulso di eccitazione I ( t) = I( t) P( t) R Il decadimento di fluorescenza misurato è la convoluzione del decadimento reale con la risposta del rivelatore I ( t) = I ( t) R( t) M R I ( t) = I( t) P( t) R( t) = I( t) i ( t) M REF La funzione di risposta dello strumento i REF è tipicamente misurata come la risposta dello strumento all impulso di eccitazione.

12 Dominio del tempo I ( t ) = [ α exp ( - t / τ) ] i ( t) M REF La funzione di risposta dello strumento i REF iè tipicamente misurata come la risposta dello strumento all impulso di eccitazione. I parametri di I(t) sono usualmente ottenuti da un fitting non lineare combinato con una procedura di deconvolution. La deconvoluzione non è necessaria quando l impulso di eccitazione è molto breve rispetto alla vita media e/o la precisione delle determinazione della vita media non è richiesta.

13 Decadimento mono-esponenziale I( t) = α exp( t / τ ) Decadimento multi-esponenziale (almeno due vite medie distinte) i ( ) = α I t e τ Un analisi analoga è effettuata nel caso di decadimento multi-esponenziale per estrarre le vite medie τ i e le frazioni α i. Un aumento del numero dei parametri nel fitting costituisce un aumento del rischio di artefatti (più di 3 vite medie non sono raccomandate). In alternativa il metodo della massima entropia può essere usato per analizzare distribuzioni continue di vite medie. Mean lifetime il tempo che mediamente una molecola spende nel suo stato eccitato i i t τ m = i i α i τ i α i

14 La fluorescenza del FAD Il FAD, Flavina Adenina Dinucleotide, è un importante coenzima ossido riduttivo che funge da accettore di elettroni e protoni. Le due basi azotate che lo compongono sono la flavina (o gruppo isoalloxazinico) e l adenina, legati a due zuccheri, rispettivamente il ribitolo e il ribosio, formando così i due nucleosidi, la riboflavina e l adenosina, tenuti insieme da un pirofosfato mediante due legami fosfoesterici.

15 λ exc = 405 nm L'anello di isoalloxazina è responsabile dell'emissione di fluorescenza del FAD nello spettro del visibile secondo tempi di decadimento che sono influenzati dalla sua interazione con l'anello aromatico di adenina. Schematicamente che la FAD esiste in due distinte conformazioni: una conformazione aperta in cui la molecola è ben distesa una conformazione chiusa in cui l'isoalloxazina e l'adenina sono impilate l'una sull'altra.

16 La fluorescenza del FAD dipende dal ph della soluzione acquosa. In soluzione acquosa a ph neutro, il decadimento di fluorescenza è bi-esponenziale α 1 = 80 % τ 1 = 300 ps per la forma chiusa α 2 = 20 % τ 2 = 2800 ps per la forma aperta Per ph < 4 e ph > 8, l equilibrio si sposta verso la forma aperta (minore attrazione dipolare tra isoalloxazina e adenina) α 2 ph

17 Apparato strumentale La strumentazione usata nell'esperienza è principalmente costituita da : un laser impulsato con frequenza di ripetizione di 40 Mhz, potenza media 2 mw, larghezza nominale dell'impulso 80 ps, lunghezza d'onda λ = 405 nm. Un rivelatore veloce basato sulla tecnica time-correlated single photon counting (TCSPC) in grado di seguire l'evoluzione temporale dei fenomeni di fluorescenza con tempi di vita media da 50 ps a 50 ns circa.