GENETICA MOLECOLARE ONCOLOGICA

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1 GENETICA MOLECOLARE ONCOLOGICA Presentazione a cura di: dott.ssa Alessandra Viel 2014 Programma Pilota concluso nel 2015 con 21 laboratori partecipanti primo turno: non ancora concluso, le valutazioni sono in fase di revisione. 20 laboratori partecipanti. Schemi Poliposi Adenomatosa del Colon (geni APC e MUTYH) Tumore ereditario della mammella e dell ovaio (geni BRCA1 e BRCA2) Sindrome di Lynch (geni MLH1 e MSH2) Obiettivi del CEQ 1. Verificare la qualità dei risultati rilasciati dai laboratori, interagendo con essi e, dove necessario, supportandoli nel miglioramento. 2. Ottenere una refertazione chiara, uniforme e completa tra i laboratori nazionali che includa una completa interpretazione del risultato in presenza di varianti patogenetiche, varianti a significato incerto, ed esito negativo del test.

2 Organizzazione del CEQ Ogni schema è costituito da due componenti: una relativa ai referti mandati dai laboratori secondo indicazioni richieste (parte retrospettiva), ed una riguardante la risoluzione di esercizi proposti. Parte retrospettiva (referti) Per ogni schema è stato chiesto ai partecipanti l invio di referti (anonimi) ed immagini di dati grezzi relativi all ultimo caso analizzato dell anno 2015 secondo le seguenti istruzioni: Ultimo caso con una variante patogenetica di uno dei due geni a scelta Ultimo caso con una variante a significato incerto di uno dei due geni a scelta Un caso refertato con risultato negativo o con variante neutra di uno dei due geni a scelta (senza dati grezzi) La richiesta ha riguardato probandi testati per la ricerca di mutazioni ignote Qualora la classificazione della variante fosse variata nel periodo compreso tra la data di refertazione e la data di inserimento dei casi nella piattaforma del CEQ, sarebbe stato necessario allegare anche il referto rettificato Esercizi proposti Sono stati inviati degli esercizi consistenti in 3 varianti per gene (=6 per schema), indicate con nomenclatura HGVS, è stato chiesto ai partecipanti di indicare la nomenclatura proteica (secondo HGVS), la sede (n. esone o per le varianti introniche l esone più vicino) e l interpretazione

3 Valutazione La parte retrospettiva e gli esercizi proposti avranno DUE VALUTAZIONI SEPARATE basate sui criteri di valutazione pre-definiti : Verifica della completezza e correttezza dei parametri di genotipizzazione, interpretazione e refertazione per la parte retrospettiva dello schema Correttezza e completezza dell interpretazione per gli esercizi inviati. Per il primo turno di CEQ (differentemente dal turno pilota), sono state definite due categorie di performance: SUFFICIENTE (con punteggi specifici) e INSUFFICIENTE. LIMITATAMENTE alla sola parte retrospettiva non saranno attribuiti punteggi di valutazione e giudizio di performance ai laboratori che: - non invieranno tutti i casi richiesti per lo schema; - invieranno i casi di anni precedenti a quello richiesto Verranno comunque commentati tutti i parametri dei casi inviati

4 Criteri di valutazione - Parte retrospettiva (Massimo punteggio ottenibile: 14 punti) Il punteggio risultante dalla valutazione sarà calcolato per sottrazione dal punteggio massimo attribuito ad ogni parametro Analisi del genotipo (max 5 punti) Qualità del dato grezzo Nomenclatura HGVS Metodo di analisi Varianti/regioni del gene analizzate Informazioni circa la validità del test Interpretazione (max 5 punti) Interpretazione assente o errata Significato patogenetico delle varianti rilevate espresso chiaramente Rimando ad ulteriori analisi, se analisi non conclusiva Rimando alla consulenza genetica Referto (max 4 punti) Formato e contenuto

5 Errori critici In ogni caso, viene assegnato un giudizio di performance insufficiente al laboratorio quando, anche per un solo caso, si verifica una delle seguenti condizioni (errori critici): 1. Genotipo non corretto, per non corrispondenza con il dato grezzo 2. Dati grezzi assenti o di scarsa qualità (non interpretabili) 3. Interpretazione del risultato in riferimento all indicazione clinica assente o classificazione errata della/e variante/i identificata/e: - Variante patogenetica (C5) classificata come a significato incerto (VUS = C3) o neutra/probabilmente neutra (C1, C2) - Variante probabilmente patogenetica (C4) classificata come neutra/probabilmente neutra (C1, C2) - VUS (C3) classificata come patogenetica/probabilmente patogenetica (C5, C4) - Variante neutra/probabilmente neutra (C1, C2) classificata come patogenetica/probabilmente patogenetica (C5, C4) La performance di un laboratorio sarà ritenuta insufficiente anche quando, pur non verificandosi nessuna delle situazioni su menzionate, la qualità generale dei referti è tale per cui non si raggiunge nella somma dei punteggi assegnati di genotipizzazione e interpretazione un punteggio di 5/10

6 VUS Human Mutation (2008) 29:

7 Criteri di valutazione - Esercizi (Massimo punteggio ottenibile: 30 punti) Il punteggio risultante dalla valutazione sarà calcolato per sottrazione dal punteggio massimo attribuito ad ogni esercizio (5 punti ogni esercizio). In ogni caso, viene assegnato un giudizio di performance insufficiente al laboratorio quando, anche per un solo esercizio, si verifica una delle seguenti condizioni (errori critici): 1. Interpretazione ASSENTE 2. Classificazione ERRATA della/e variante/i identificata/e: - Variante patogenetica (C5) classificata come a significato incerto (VUS = C3) o neutra/probabilmente neutra (C1, C2) - Variante probabilmente patogenetica (C4) classificata come neutra/probabilmente neutra (C1, C2) - VUS (C3) classificata come patogenetica/probabilmente patogenetica (C5, C4) - Variante neutra/probabilmente neutra (C1, C2) classificata come patogenetica/probabilmente patogenetica (C5, C4)

8 GENETICA MOLECOLARE ONCOLOGICA I Turno 20 Laboratori partecipanti n. Poliposi Adenomatosa Familiare del Colon Tumore Ereditario della Mammella e dell'ovaio Sindrome di Lynch Poliposi Adenomatosa del Colon: 9 laboratori Tumore Ereditario della Mammella e dell'ovaio: 16 laboratori Sindrome di Lynch: 12 laboratori Parte retrospettiva Referti richiesti: 111 Referti valutati: 105 (6 referti non inviati per mancanza di casi) Esercizi Esercizi valutati: x 2 x x 3 x x x 4 x x 5 x 6 x 7 x x 8 x 9 x x x 10 x x x 11 x x x 12 x 13 x x 14 x 15 x 16 x x 17 x x 18 x x x 19 x x 20 x

9 Poliposi Adenomatosa Familiare del Colon parte retrospettiva Sono stati chiesti gli ultimi casi analizzati nell anno 2015 di uno dei due geni - APC o MUTYH - secondo le seguenti istruzioni: 1. Ultimo caso con una variante patogenetica di uno dei due geni a scelta 2. Ultimo caso con una variante a significato incerto di uno dei due geni a scelta 3. Ultimo caso refertato con risultato negativo o con variante neutra di uno dei due geni a scelta 6 laboratori su 9 non hanno commesso errori critici e otterranno un giudizio di performance sufficiente 1 laboratorio non ha presentato un referto del caso VUS, non avrà quindi un giudizio di performance, saranno comunque commentati gli altri casi 1 laboratorio ha presentato un referto del caso Patogenetico del 2014, inoltre nel caso VUS ha sottomesso un caso C1, non avrà quindi un giudizio di performance 1 laboratorio otterrà un giudizio di performance insufficiente per errore di interpretazione

10 Interpretazione errata il laboratorio non considera il carattere recessivo del gene MUTYH Il test è dichiarato Positivo, ma manca un interpretazione clinica del risultato. Manca un rimando alla consulenza genetica

11 Poliposi Adenomatosa Familiare del Colon Esercizi proposti Variante (nomenclatura HGVS a livello di DNA) Conseguenza a livello proteico (nomenclatura internazionale) Sede della variante (N. Esone/Introne) Interpretazione della variante a scopo clinico ed eventuali commenti (come comparirebbero sul referto) c.3920t>a p.(ile1307lys) 15G VUS è la variante degli Ashkenazi su cui c'è molta letteratura Gene APC c.7514g>a p.(arg2505gln) 15T VUS in InSight c.1262_1263delgginsaa p.(trp421*) 9 PAT in InSight c.1437_1439del p.(glu480del) 14 PAT in InSight Gene MUTYH c.544c>t p.(arg182cys) 7 VUS in InSight c.1276c>t p.(arg426cys) 13 VUS in InSight

12 Gene APC Lab c.3920t>a c.7514g>a Valutazione preliminare c.1262_1263delggin saa Gene MUTYH c.1437_1439del c.544c>t c.1276c>t 1 corretto corretto corretto corretto corretto corretto 2 corretto corretto corretto corretto corretto corretto 3 corretto corretto corretto corretto C3>C5 corretto 4 corretto corretto corretto corretto corretto corretto 5 C3>C1,2 corretto corretto corretto corretto corretto 6 corretto C3>C1,2 corretto corretto corretto corretto 7 C3>C1,2 corretto corretto corretto corretto C3>C1,2 8 corretto C3>C1,2 corretto corretto corretto corretto 9 C3>C1,2 corretto corretto corretto corretto corretto C3>C5: variante a significato incerto interpretata come variante patogenetica C3>C1,2: variante a significato incerto interpretata come variante a scarso o nullo significato, errore non critico ma penalizzabile

13 Tumore ereditario della mammella e dell ovaio parte retrospettiva Sono stati chiesti referti degli ultimi casi analizzati nell anno 2015 di uno dei due geni - BRCA1 o BRCA2 - secondo le seguenti istruzioni: 1. Ultimo caso con una variante patogenetica di uno dei due geni a scelta 2. Ultimo caso con una variante a significato incerto di uno dei due geni a scelta 3. Ultimo caso refertato con risultato negativo o con variante neutra di uno dei due geni a scelta 12 laboratori su 16 non hanno commesso errori critici e otterranno un giudizio di performance sufficiente 1 laboratorio non ha presentato un referto del caso VUS, non avrà quindi un giudizio di performance, ma riceverà dei commenti circa gli altri casi. Inoltre nel caso normale interpreta una variante C3 come C1 (BRCA1 p.arg1028cys) 1 laboratorio otterrà un giudizio di performance insufficiente per errore di genotipizzazione sui dati grezzi del caso VUS INOLTRE

14 1 laboratorio nel caso Patogenetico ha indicato una mutazione BRCA2 come BRCA1, inoltre tutte le varianti polimorfiche (C1) trovate sono indicate come C2 o non note in tutti e tre i casi presentati. Lo stesso laboratorio nel caso VUS ha sottomesso un caso C1 riportandolo come C3 1 laboratorio otterrà un giudizio di performance insufficiente per errore di genotipizzazione (errore di nomenclatura grave) il genotipo, così come descritto (c.8475delga...) non corrisponde al dato grezzo (c.8247_8248delga). La annotazione risulta un mix tra nomenclatura database BIC e nomenclatura HGVS Errore che potrebbe avere ripercussioni sull'attendibilità del test

15 Tumore ereditario della mammella e dell ovaio Esercizi proposti Variante (nomenclatura HGVS a livello di DNA) Conseguenza a livello proteico (nomenclatura internazionale) Sede della variante (N. Esone/Introne) c.5062_5064delgtt p.val1688del 17 Interpretazione della variante a scopo clinico ed eventuali commenti (come comparirebbero sul referto) C5 Malacrida et al_jco 2008 Gene BRCA1 c.5017_5019delcac p.his1673del 17 c g>c (IVS19-1G>C) p.? 19 c.6953g>a p.arg2318gln 13 C3 anche se localizzata in un dominio funzionalmente importante C4 no dati in vitrp C2 Chenevix-Trench et al_cancer Res 2006 Gene BRCA2 c.9154c>t p.arg3052trp 24 C5 Guidugli_Cancer Res 2013 c.10095_10095delinsgaat TATATCT p.ser3366asnfs*4 27 C1 downstream Lys3326

16 Gene BRCA1 Valutazione preliminare Lab c.5062_5064delgtt c.5017_5019delcac c g>c (IVS19-1G>C) c.6953g>a c.9154c>t Gene BRCA2 c.10095_10095delinsgaattatat CT 1 corretto corretto corretto corretto corretto corretto 2 corretto corretto corretto corretto corretto corretto 3 corretto corretto corretto corretto corretto corretto 4 corretto corretto corretto corretto corretto corretto 5 corretto corretto C4>C5 corretto corretto corretto 6 due interpretazioni corretto non interpretata non interpretata non interpretata C1>C3 7 corretto corretto corretto corretto corretto corretto 8 C5>C3 corretto C4>C3 corretto C5>C3 corretto 9 C5>C3 corretto corretto corretto corretto corretto 10 corretto corretto corretto corretto corretto corretto 11 corretto C3>C4 corretto corretto corretto corretto 12 C5>C3 corretto corretto corretto C5>C4 C1>C3 13 corretto corretto corretto corretto corretto corretto 14 corretto corretto C4>C3 corretto corretto corretto 15 corretto corretto corretto corretto corretto corretto 16 corretto corretto corretto corretto corretto corretto C5>C3 variante patogenetica interpretata come variante a significato incerto, in tutti i casi i laboratori hanno controllato solamente BIC dove viene ancora riportata come VUS C3>C4 variante a significato incerto interpretata come probabilmente patogenetico

17 Sindrome di Lynch parte retrospettiva Sono stati chiesti i referti degli ultimi casi analizzati nell anno 2015 di uno dei due geni - MLH1 o MSH2 - secondo le seguenti istruzioni: 1. Ultimo caso con una variante patogenetica di uno dei due geni a scelta 2. Ultimo caso con una variante a significato incerto di uno dei due geni a scelta 3. Ultimo caso refertato con risultato negativo o con variante neutra di uno dei due geni a scelta 3 laboratori su 12 non hanno commesso errori critici e otterranno un giudizio di performance sufficiente 4 laboratori non hanno presentato un referto (2 casi patogenetici, due casi VUS), non avranno quindi un giudizio di performance, ma riceveranno commenti circa gli altri casi 2 laboratori hanno presentato dei referti di casi con mutazione in MSH6, non avranno quindi un giudizio di performance, ma riceveranno commenti circa gli altri casi 3 laboratori hanno ottenuto un giudizio di performance insufficiente per non aver usato la tecnica MLPA per la ricerca di grandi delezioni e non aver riportato l eventuale rimando a tale esame, nei casi VUS e normali

18 Variante (nomenclatura HGVS a livello di DNA) Sindrome di Lynch Esercizi proposti Conseguenza a livello proteico (nomenclatura internazionale) Sede della variante (N. Esone/Introne) Interpretazione della variante a scopo clinico ed eventuali commenti (come comparirebbero sul referto) c.1852_1853delaains GC p.(lys618ala) 16 Class 1 Gene MLH1 c.1852_1854del p.(lys618del) 16 Class 5 c.454-?_545+?dup p.(?) 6 Class 3 c c>t p.(?) 16 (intr 15) Class 3 Gene MSH2 c a>t p.(?) 7 (intr 6) Class 4 c.1046c>g p.(pro349arg) 6 Class 5

19 Valutazione preliminare Gene MLH1 Gene MSH2 Lab c.1852_1853delaainsgc c.1852_1854del c.454-?_545+?dup c c>t c a>t c.1046c>g 1 corretto corretto C3>C5 corretto C4>C5 corretto 2 corretto corretto corretto corretto corretto corretto 3 corretto corretto interpretazione assente C3>C5 corretto corretto 4 corretto corretto C3>C5 corretto corretto corretto 5 corretto corretto C3>C5 corretto corretto corretto 6 corretto corretto C3>C5 C3>C2 corretto corretto 7 corretto corretto corretto corretto corretto corretto 8 corretto corretto corretto corretto corretto corretto 9 corretto corretto C3>C5 corretto corretto corretto 10 corretto corretto corretto corretto corretto corretto 11 corretto corretto corretto corretto corretto corretto 12 corretto corretto corretto corretto corretto corretto C3>C5 variante a significato incerto interpretata come variante patogenetica

20 c.454-?_545+?dup Classe 3 LOVD-InSiGHT rules Class 5 Pathogenic.. Large genomic deletions Large genomic duplications shown by laboratory studies to result in a frameshift before the last splice junction Class 3 Uncertain Variants that have insufficient evidence (molecular or otherwise) to classify, which may include large genomic duplications not yet shown by laboratory studies to result in a frameshift before the last splice junction,..

21 MLPA - Casi presentati Fatta esclusione di tutti i casi patogenetici è importante l utilizzo di MLPA (o seconda tecnica alternativa) o almeno il rimando alla necessità di proseguire l'analisi con ulteriori test per valutare la presenza di grandi delezioni o duplicazioni * Indice di importanza: BRCA1 e 2 ~5% Penalizzazione o commento APC ~10% Grossa penalizzazione MLH1 e MSH2 ~20% Errore critico *gene MUTYH: Non rilevante, eccetto nel caso sia presente una sola variante patogenetica in eterozigosi Per lo schema della Poliposi Adenomatosa del Colon Tra i 17 casi valutati tra VUS e WT, 12 riguardavano l analisi del gene APC 4 casi (3 laboratori): utilizzano l MLPA 2 casi (2 laboratori): non eseguono la seconda tecnica, ma ne rimandano la necessità 6 casi (3 laboratori): non eseguono la seconda tecnica e non viene riportata la necessità di proseguire l'analisi con ulteriori test

22 Per lo schema della Sindrome di Lynch Su 22 casi valutati tra VUS e WT: 9 casi (5 laboratori) utilizzano l MLPA 4 casi (2 laboratori) non eseguono la seconda tecnica, ma ne rimandano la necessità 9 casi (5 laboratori) non eseguono la seconda tecnica e non viene riportata la necessità di proseguire l'analisi con ulteriori test 1 caso (1 laboratorio) non è si è potuto valutare la necessità della seconda tecnica per carenza di informazioni nel referto In questo esempio nel referto NON vengono nemmeno riportati i limiti del test (non permette di evidenziare delezioni o duplicazioni dell intero gene e di interi esoni) Non è corretto indicare "regioni analizzate: tutte" andrebbero descritte le regioni, inserendo anche l'analisi delle giunzioni introne/esone.

23 In questo secondo esempio, nelle informazioni tecniche allegate al referto è esplicitato che NGS non vede delezioni/duplicazioni >100 bp. MLPA non fatto, ma nel referto non viene riportata la necessità di proseguire l'analisi con ulteriori test.

24 Terzo esempio: Utilizza NGS- Ion Torrent ma non ne vengono forniti i dettagli, non riporta l utilizzo del sequenziamento Sanger di conferma. Non valutabile se MLPA necessario in associazione con tecnica NGS utilizzata

25 Next Generation Sequencing NGS utilizzato da 10/20 laboratori partecipanti (50%) L utilizzo dell NGS va preceduto da percorsi di validazione dello specifico approccio utilizzato, dai quali andrebbero derivati i parametri di specificità, sensibilità, ecc (non ha alcun senso riportare valori teorici che poco o nulla hanno a che vedere con lo specifico test utilizzato) Oltre alla validazione e/o eventuale certificazione (CE-IVD) dell approccio, o parte di esso, nel referto vanno inoltre fornite anche alcune informazioni relative ad esempio a: Piattaforma Tecnica di arricchimento Kit commerciale Copertura del target Profondità minima di lettura Indicazione sommaria della pipeline bioinformatica D altro canto, almeno nella fase di transizione dell NGS in ambito diagnostico, si sconsigliano anche referti con lunghi allegati tecnici incomprensibili ai più. È inoltre essenziale la conferma tramite una seconda metodica di eventuali varianti identificate in NGS (il prossimo anno come da linee guida SIGU, ai laboratori che utilizzano questa metodica verrà richiesto di presentare i dati di validazione mediante sequenziamento Sanger)

26 Database & Interpretazione esercizi proposti I laboratori non dovrebbero limitarsi a riportare le classificazioni descritte nei database, ma dovrebbero piuttosto avere una capacità critica di interpretazione della variante, soprattutto nelle situazioni in cui le classificazioni di differenti database non sono concordi. Alcuni Database UTILI per l interpretazione BRCA1 e BRCA2 ARUP ( Breast Information Core (BIC) ( BRCA share BRCA1 ( BRCA share BRCA2 ( LOVD IARC ( Clin Var ( ENIGMA ( APC e MUTYH MLH1 e MSH2 LOVD-InSiGHT ( UMD ( Clin Var (

27 Partecipano al gruppo di lavoro di esperti: Dott.ssa Liliana Varesco IRCCS AOU San Martino IST - Genova Dott. Paolo Radice Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori - Milano Dott. Marco Montagna - Istituto Oncologico Veneto (IRCCS-IOV) - Padova Dott.ssa Alessandra Viel IRCCS - Centro Riferimento Oncologico - Aviano Gruppo di lavoro ISS Responsabile dott.ssa Domenica Taruscio Fabrizio Tosto Federica Censi Maria Chiara de Stefano Giovanna Floridia Marco Salvatore Daniele Savino Gianluca Ferrari