Utilizzo dei QuEChERS nella determinazione di IPA in alimenti di origine animale
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- Giancarlo Bevilacqua
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1 Utilizzo dei QuEChERS nella determinazione di IPA in alimenti di origine animale Dr. Albino Gallina, Dr. Valentino Pizzocchero Laboratorio di Tossicologia Alimentare Chimica Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie
2 L evoluzione 2010: viene accreditata per la ricerca del solo benzo(a)pirene 2012: viene accreditata per la ricerca di 4 IPA e per estensione di matrice (prodotti carnei) 2014: studi sull applicabilità nei formaggi
3 L idea Avere una procedura semplice e veloce, che permettesse il processamento di un elevato numero di campioni, per la determinazione di Idrocarburi Policiclici Aromatici (IPA) in alimenti di origine animale, in particolare nei prodotti ittici e carnei. Siamo partiti da una nota applicativa dell Agilent Analysis of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Fish with agilent SampliQ Quechers
4 Gli aspetti tecnici Quali QuEChERS? Original (15 g samples), con 6 g MgSO 4, 1.5 g NaCl Dispersive SPE 15 ml, Fatty Samples AOAC con 400 mg PSA, 400 mg C18 EC e 1200 mg MgSO 4 Ceramic Bars Homogenizers Quale cromatografia? Sistema HPLC a gradiente Waters Alliance Empower con rilevatore Fluorimetrico Multi 2475 (2 canali) Colonna cromatografica LC-PAH Supelcosil 5 μm 150 * 3,0 mm
5 Preparazione del campione Campione scongelato e omogeneizzato Prelevare ~3 g di campione e trasferirli in provette monouso da 50 ml; Aggiungere una Ceramic Bar Homogenizer nella provetta; Aggiungere 10 ml di acqua bidistillata ed agitare su agitatore orizzontale per 15 minuti; Aggiungere 12 ml di acetonitrile ed agitare su agitatore orizzontale per 15 minuti; Aggiungere il quantitativo di sali contenuto in Quechers Pouch (MgSO4, NaCl) ed agitare vigorosamente per un minuto esatto; Centrifugare per 10 minuti a 5000 g.
6 Purificazione del campione Prelevare 4 ml di surnatante e porli nella Dispersive SPE da 15 ml; Agitare vigorosamente per un minuto esatto; Centrifugare per 10 minuti a 3200 xg; Filtrare ~1,5 ml di surnatante attraverso filtro PVDF monouso da 0,45 μm in vial di vetro. Procedere all analisi strumentale.
7 Condizioni strumentali Gradiente Tempo [min] Acqua [%] Acetonitrile [%] Flusso [ml/min] , , , , , ,5 Volume di iniezione: 30 μl Temperatura vials autocampionatore: 10 C Temperatura Colonna: 30 C
8 Rivelatore Fluorimetrico Tempo [min] λ di eccitazione [nm] λ di emissione [nm] Canale A B B B B Per il crisene si utilizza il canale A Per benzo(a)antracene, benfo(b)fluorantene e benzo(a)pirene si utilizza il canale B
9 Quantificazione Mediante curva di taratura in solvente Punto 1: 0,225 μg/l di IPA equivalente a 0,9 μg/kg nel campione. Punto 2: 0,5 μg/l di IPA equivalente a 2 μg/kg nel campione. Punto 3: 1,25 μg/l di IPA equivalente a 5 μg/kg nel campione. Punto 4: 3,75 μg/l di IPA equivalente a 15 μg/kg nel campione. Punto 5: 7,5 μg/l di IPA equivalente a 30 μg/kg nel campione.
10 Validazione Parametri: Recupero Ripetibilità (HORRAT) Intervallo linearità Effetto matrice Specifictà LOD LOQ Robustezza
11 Validazione Schema: 6 campioni e tre livelli di contaminazione per ogni matrice 5 diverse matrici Matrice Categoria Livello 1 [µg/kg] Livello 2 [µg/kg] Vongole Molluschi bivalvi 0, Spratti affumicati Spratti affumicati 0, Trota affumicata Pesce affumicato 0,9 2 5 Speck Carni affumicate 0,9 2 5 Pancetta affumicata Carni grasse affumicate 0,9 2 5 Livello 3 [µg/kg]
12 Prestazioni ottenute MOLLUSCHI BIVALVI Ripetibilità (%) [HORRAT] Recupero (%) LOQ BaA: 1,7 [0,12] CHR: 11 [0,80] BbFA: 1,3 [0,092] BaP: 1,6 [0,11] BaA: 88 CHR: 92 BbFA: 83 BaP: 76 0,9 µg/kg (reale 0,3-0,5 µg/kg) REG CE 836/2011 HORRAT < % 0,9 µg/kg
13 Prestazioni ottenute SPRATTI AFFUMICATI Ripetibilità (%) [HORRAT] Recupero (%) LOQ BaA: 1,4 [0,10] CHR: 4,4 [0,30] BbFA: 1,2 [0,08] BaP: 1,1 [0,08] BaA: 69 CHR: 85 BbFA: 71 BaP: 62 0,9 µg/kg (reale 0,3-0,5 µg/kg) REG CE 836/2011 HORRAT < % 0,9 µg/kg
14 Prestazioni ottenute PESCE AFFUMICATO Ripetibilità (%) [HORRAT] Recupero (%) LOQ BaA: 1,0 [0,07] CHR: 4,4 [0,30] BbFA: 2,9 [0,20] BaP: 2,0 [0,14] BaA: 80 CHR: 79 BbFA: 91 BaP: 73 0,9 µg/kg (reale 0,3-0,5 µg/kg) REG CE 836/2011 HORRAT < % 0,9 µg/kg
15 Prestazioni ottenute CARNI AFFUMICATE Ripetibilità (%) [HORRAT] Recupero (%) LOQ BaA: 1,6 [0,11] CHR: 16 [1,1] BbFA: 1,6 [0,11] BaP: 2,9 [0,20] BaA: 83 CHR: 83 BbFA: 77 BaP: 67 0,9 µg/kg (reale 0,3-0,5 µg/kg) REG CE 836/2011 HORRAT < % 0,9 µg/kg
16 Prestazioni ottenute CARNI AFFUMICATE GRASSE Ripetibilità (%) [HORRAT] Recupero (%) LOQ BaA: 5,1 [0,35] CHR: 16 [1,1] BbFA: 1,6 [0,11] BaP: 1,9 [0,13] BaA: 77 CHR: 100 BbFA: 68 BaP: 57 0,9 µg/kg (reale 0,3-0,5 µg/kg) REG CE 836/2011 HORRAT < % 0,9 µg/kg
17 Standard 1,25 µg/kg
18 Speck fortificato a 2 µg/kg
19 Mitili fortificati a 5 µg/kg
20 12th Interlaboratory Comparison (2013) - PAHs in bivalve molluscs Molecola Valore assegnato Valore riscontrato benz[a]antracene 3,66 µg/kg 3,7 µg/kg 0,0 crisene 5,28 µg/kg 5,4 µg/kg 0,1 benzo[b]fluorantene 4,85 µg/kg 4,8 µg/kg -0,1 benzo[a]pirene 3,99 µg/kg 4,5 µg/kg 0,5 PAH somma 17,78 18,4 µg/kg 0,5 Z-score
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