SOLUZIONI AI PROBLEMI DEL CAPITOLO 17

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1 SOLUZIONI AI PROBLEMI DEL CAPITOLO 17 Domande concettuali C1. A livello molecolare, lo scambio tra cromatidi fratelli (SCE) e la ricombinazione che riguarda gli omologhi sono molto simili. Segmenti di DNA identici (SCE) oppure simili (ricombinazione omologa) si allineano e attuano un crossing-over. Sulla base delle similitudini a livello molecolare dei due processi, ci si aspetterebbe che i due eventi siano catalizzati dagli stessi tipi di proteine. Tuttavia, a livello genetico, gli eventi sono diversi. Gli SCE non determinano la ricombinazione degli alleli, perché i cromatidi sono geneticamente identici. La ricombinazione omologa solitamente porta a una nuova combinazione allelica dopo che è avvenuto il crossing-over. C2. La migrazione della ramificazione non porterà alla formazione di un eteroduplex durante l SCE perché i cromatidi fratelli sono geneticamente identici. Non dovrebbero esserci appaiamenti errati tra filamenti complementari. La conversione genica non può avvenire perché i cromatidi fratelli portano alleli identici tra loro. C3. Le fasi sono descritte nella Figura A. Le estremità dei filamenti sottoposti a rottura non verrebbero riconosciute e degradate. B. La proteina RecA non riconoscerebbe le estremità a singolo filamento, e l'invasione del filamento nella doppia elica omologa non avverrebbe. C. Non si formerebbero le giunzioni di Holliday. D. Senza queste proteine non avverrebbe la migrazione della ramificazione, e non potrebbe verificarsi la risoluzione delle eliche interconnesse. C4. I due meccanismi molecolari che possono spiegare il fenomeno della conversione genica sono la riparazione degli appaiamenti scorretti e la sintesi riparativa delle interruzioni. Entrambi i meccanismi potrebbero verificarsi nel modello della rottura a doppio filamento. C5. Solitamente, l'effetto netto generale della ricombinazione omologa non è quello di creare nuove mutazioni in particolari geni. Tuttavia, la ricombinazione omologa crea delle nuove combinazioni di alleli lungo particolari cromosomi. Questo può essere considerato come una mutazione, perché la sequenza di un cromosoma è stata alterata in modo ereditabile. C6. Un cromosoma ricombinante deriva da un crossing-over e contiene una combinazione di alleli diversa da quella dei cromosomi parentali. Il cromosoma ricombinante è un ibrido tra i due cromosomi parentali. C7. Questo dipende dal modo con cui avvengono i tagli dei filamenti del DNA durante la fase di risoluzione. Se le due rotture avvengono nei filamenti di DNA che hanno subito crossing-over, ne risultano cromosomi non ricombinanti. Se i due tagli avvengono nei filamenti che non hanno partecipato allo scambio, il risultato è una coppia di cromosomi ricombinanti. C8. La conversione genica avviene quando una coppia di alleli diversi viene convertita in una coppia di alleli identici. Per esempio, una coppia di alleli Bb potrebbe essere convertita in BB oppure bb. C9. Il modello di Holliday propone due rotture, una in ciascun cromatidio, e, in seguito, entrambi i filamenti scambiano una porzione del DNA a singolo filamento. Il modello della rottura a

2 doppio filamento propone due tagli, entrambi nello stesso cromatidio. Come nel modello di Holliday, la migrazione a singolo filamento avviene tre i due omologhi. Il modello della rottura a doppio filamento propone anche la degradazione del filamento e la sintesi riparativa del DNA. Infine, il modello della rottura a doppio filamento genera due giunzioni di Holliday, e non semplicemente una. C10. È probabile che la conversione genica avvenga vicino al punto di rottura. Secondo il modello della rottura a doppio filamento, mediante la digestione di un filamento di DNA nella doppia elica si può creare un interruzione. La sintesi riparativa può risultare nella conversione genica. Un secondo modo nel quale può avvenire la conversione genica è mediante la riparazione degli appaiamenti errati. Dopo la migrazione del filamento di DNA può formarsi un eteroduplex che può venire riparato in modo da causare la conversione genica. C11. La proteina RecA si lega al DNA a singola elica e forma un filamento. Il filamento scivola lungo un'altra regione del DNA fino a quando riconosce le sequenze omologhe. Dopo il riconoscimento, la proteina RecA media il movimento del filamento invasore e la dislocazione del filamento originale C12. No, non coinvolge necessariamente la riparazione degli appaiamenti errati; la conversione genica potrebbe coinvolgere anche la sintesi riparativa. Il modello della rottura a doppio filamento comporta la migrazione dei filamenti di DNA e la digestione di un interruzione. Perciò, in questa regione interrotta solo un cromatidio fornisce i filamenti di DNA. Come si vede nella Figura 17.5, il cromosoma in alto usa il filamento superiore del cromosoma posto in basso nella regione interrotta. Il cromosoma in basso usa il filamento inferiore del cromosoma superiore. Dopo la sintesi di DNA, entrambi i cromosomi possono presentare lo stesso allele. C13. RecG e RuvABC si legano alle giunzioni di Holliday. Esse non riconoscono necessariamente una sequenza di DNA, ma identificano una regione di crossing-over (cioè una struttura a quattro filamenti). C14. Primo, il riarrangiamento genico dei domini V, D, e J avviene all interno dei geni per la catena leggera e per quella pesante. Secondo, in una determinata cellula B sono possibili diverse combinazioni di catene leggere e pesanti. Terzo, può verificarsi la fusione imprecisa tra i domini V, D, e J. C15. La funzione delle proteine RAG1 e RAG2 è quella di riconoscere le sequenze segnale per la ricombinazione e generare due rotture a doppio filamento. Esse generano un taglio all'estremità di una regione V e all'inizio di una regione J. Le proteine NHEJ riconoscono le estremità e le saldano tra loro. Questa è una forma di splicing del DNA che crea combinazioni diverse delle regioni V, J, D, e C, generando di conseguenza un ampia gamma di diversità tra gli anticorpi codificati. C16. Un segmento di DNA che comprende alcuni domini variabili (V) e forse uno o più domini di giunzione (J) viene rimosso dal gene per la catena leggera κ. Un segmento che può includere uno o più domini J e la regione compresa tra il dominio J e il dominio C viene rimosso durante la maturazione del pre-mrna. C17. L integrasi è un enzima che riconosce le sequenze che costituiscono i siti di attacco all'interno del DNA di λ e del cromosoma di E. coli. Esso mette in contatto il DNA di λ al cromosoma e opera dei tagli sfalsati nei siti di attacco. I filamenti vengono scambiati, e le estremità legate tra loro. In questo modo, il DNA di λ viene inserito in un sito preciso all'interno del cromosoma di E. coli.

3 C18. Le estremità di una breve regione sarebbero fiancheggiate da sequenze ripetute dirette. Questa è una caratteristica universale di tutti gli elementi trasponibili. Inoltre, molti elementi contengono IR oppure LTR che sono coinvolte nel processo della trasposizione. Si potrebbe anche cercare la presenza di un gene per la trasposasi oppure per la trascrittasi inversa, sebbene questa non sia una caratteristica necessaria, perché gli elementi trasponibili non autonomi tipicamente sono privi della trasposasi oppure della trascrittasi inversa. C19. Nella Figura 17.11, l elemento trasponibile si è trasposto prima della replicazione del DNA. Il trasposone è a singolo filamento in entrambe le localizzazioni. La replicazione del DNA (cioè la sintesi riparativa) copia gli elementi a singolo filamento in elementi a doppio filamento. Perciò, il risultato finale è di due elementi trasponibili a doppio filamento in due siti distinti. C20. Le ripetizioni dirette si formano perché la trasposasi oppure l integrasi producono tagli sfalsati nei due filamenti di DNA cromosomico. L elemento trasponibile viene poi inserito all interno di questo sito, che lascia temporaneamente due interruzioni, le quali vengono riempite dalla DNA polimerasi. Siccome ciò avviene grazie alla complementarietà delle sequenze nucleotidiche, le due interruzioni avranno infine la stessa identica sequenza. C21. I retroelementi hanno maggiore potenziale proliferativo, perché l'elemento viene trascritto nell'intermedio a RNA. Possono essere trascritte molte copie di questo RNA e poi copiate in DNA mediante la trascrittasi inversa. In teoria, in una singola generazione potrebbero essere inserite nel genoma molte copie dell'elemento. C22. Gli elementi trasponibili sono mutageni, perché essi alterano le sequenze dei cromosomi e dei geni all interno dei cromosomi, inserendosi all interno dei geni. C23. Ricorda che ogni tipo di trasposasi riconosce solamente le sequenze ripetute invertite di un particolare tipo di elemento trasponibile. Le zanzare devono esprimere una trasposasi che riconosca gli elementi Z. Questo spiega perché gli elementi siano mobili. Questa trasposasi degli elementi Z non deve riconoscere le sequenze ripetute invertite degli elementi X; le sequenze ripetute invertite degli elementi X e degli elementi Z devono avere sequenze diverse. Questo stesso gruppo di zanzare non deve esprimere una trasposasi che inserisca gli elementi X. Questo spiega perché gli elementi X siano molto stabili. C24. A. I retroelementi di tipo virale e quelli non virali B. Sequenze di inserzione, trasposoni composti, e trasposoni replicativi C. Tutti i cinque tipi hanno sequenze ripetute dirette D. Le sequenze di inserzione, i trasposoni composti, e i trasposoni replicativi C25. Un trasposone viene escisso come un segmento di DNA, e poi esso si traspone in una nuova localizzazione grazie all'azione della trasposasi. Un retroelemento viene trascritto come RNA, e poi la trascrittasi inversa lo trasforma in una copia di DNA a doppio filamento. L'integrasi poi inserisce questa copia di DNA nel cromosoma. Tutti gli elementi trasponibili hanno sequenze ripetute dirette. I trasposoni che si spostano sotto forma di DNA possiedono sequenze ripetute invertite, e possono codificare una trasposasi (oltre ad altri geni). I retroelementi non presentano sequenze ripetute invertite, ma possono possedere o meno LTR. I retroelementi autonomi codificano la trascrittasi inversa e l'integrasi. C26.

4 A. Come mostrato nel problema risolto R2a, un crossing-over tra le sequenze ripetute dirette (DR) porterà all escissione della regione compresa tra le ripetizioni. In questo caso, verrà escissa e perduta una grande regione cromosomica, che non contiene un centromero. La porzione rimanente del cromosoma è illustrata di seguito. Essa presenta una sequenza ripetuta diretta formata in parte dalla DR-1 e in parte dalla DR-4. Essa viene indicata come DR-1/4. B. Un crossing-over tra IR-1 e IR-4 determinerà un inversione della regione che li separa. Questo effetto è simile al crossing-over in un singolo elemento trasponibile, come descritto nel problema risolto R2b. La differenza è che il crossing-over determina l inversione di un ampia regione cromosomica. Trasposone Trasposone C27. Un elemento trasponibile autonomo ha i geni necessari per la trasposizione. Per esempio, un elemento trasponibile autonomo possiede anche il gene per la trasposasi. Un elemento trasponibile non autonomo non possiede tutti i geni necessari per la trasposizione. Tuttavia, se la cellula contiene un elemento autonomo e un elemento non autonomo dello stesso tipo, l'elemento non autonomo può spostarsi. Per esempio, se una cellula di Drosophila possiede due elementi P, uno autonomo e l altro non autonomo, la trasposasi espressa dall'elemento P autonomo potrebbe riconoscere l'elemento P non autonomo e catalizzarne la sua trasposizione. C28. Con frequenza di circa 1 su , si verifica la ricombinazione tra le sequenze ripetute invertite all interno di questo trasposone. Come descritto nel problema risolto R2b, la ricombinazione tra sequenze ripetute invertite determina l inversione della sequenza all interno del trasposone. Se questo si verifica in un ceppo che esprimeva l operone H2/rH1 il promotore verrebbe ruotato nell orientamento opposto, così che i geni H2 e rh1 non verrebbero espressi. La proteina flagellare H2 non verrebbe prodotta, e nemmeno la proteina repressore H1. Sarebbe invece prodotta la proteina flagellare H1, perché l espressione del gene H1 non sarebbe repressa. Anche il ceppo che esprime il gene H1 potrebbe cambiare con una frequenza di 1 su mediante lo stesso meccanismo. Se si verificasse un crossing-over tra le sequenze ripetute

5 invertite dell elemento trasponibile, il promotore verrebbe ruotato nuovamente, e i geni H2 e rh1 sarebbero nuovamente espressi. C29.La formazione delle delezioni e delle inversioni è descritta anche nella risposta alla domanda concettuale C26. Una delezione può presentarsi quando avviene la ricombinazione tra due Trasposone Trasposone Dopo la ricombinazione elementi diversi che si allineano nella stessa direzione. Questa regione compresa tra gli elementi viene deleta. Un'inversione si ha quando la ricombinazione coinvolge due elementi diversi orientati in direzioni opposte. Una traslocazione avviene quando la ricombinazione coinvolge elementi trasponibili localizzati in cromosomi non omologhi. In altre parole, gli elementi trasponibili posti in cromosomi diversi si allineano e avviene un crossing-over. Questo produrrà una traslocazione, come illustrato di seguito: Domande sperimentali S1. A causa del meccanismo semiconservativo della replicazione del DNA, uno dei cromatidi fratelli contiene BrdU nei due filamenti di DNA, mentre l'altro cromatidio fratello la contiene BrdU solamente in uno dei due filamenti di DNA. S2. Concluderesti che il substrato è un mutageno. Le sostanze che danneggiano il DNA aumentano il livello degli scambi genetici quali gli SCE. S3. Dovresti aggiungere il mutageno dopo il secondo ciclo di replicazione ma prima che avvenga il crossing-over durante la mitosi (quindi aggiungerlo durante la fase G 2 ). In questo esperimento stai cercando gli scambi tra cromatidi fratelli (SCE) che si verificano dopo il secondo ciclo di replicazione del DNA. Se il mutageno può persistere nelle cellule per un lungo periodo, potresti aggiungerlo in una fase precedente. S4. Il disegno di seguito illustra la progressione attraverso tre cicli di esposizione alla BrdU. Dopo una replicazione, tutti i cromosomi saranno colorati in modo omogeneo. Dopo due cicli di replicazione, tutti i cromosomi saranno arlecchino. Dopo tre replicazioni, il numero di cromatidi fratelli chiari sarà il doppio del numero di cromatidi fratelli chiari presenti dopo due cicli di replicazione.

6 Dopo la seconda replicazione Dopo la seconda replicazione Un singolo scambio tra cromatidi fratelli S5. Come descritto nel Capitolo 8, il legame del colorante Giemsa ai cromosomi produce le bande G, che sono scure. I cromatidi in cui entrambi i filamenti contengono BrdU appaiono chiari, a indicare che la BrdU inibisce il legame del colorante Giemsa.

7 S6. Quando McClintock iniziò con un ceppo incolore contenente Ds, identificò 20 casi in cui Ds si era spostato in un nuovo sito per produrre chicchi rossi e raggrinziti. L identificazione fu possibile perché i 20 ceppi manifestavano rotture cromosomiche in un sito specifico con frequenza maggiore, grazie alla mutabilità di particolari geni. McClintock identificò anche un ceppo dove Ds era inserito in un gene per la produzione del colore rosso, determinando un fenotipo incolore, così che la sua escissione dal gene determinava un settore rosso. Nell insieme, la sua analisi dei dati stabilì che la presenza dei settori (quindi la mutabilità) era in accordo con la trasposizione di Ds. S7. Il fenotipo rosso è determinato dall escissione di un elemento trasponibile. Questa conclusione si basa sulla reversione del fenotipo (cioè da incolore a rosso), che suggerisce un recupero della funzione genica e assenza di mutazioni fenotipica. S8. Il transposon tagging è un metodo sperimentale il cui scopo è quello di clonare i geni. Con questo approccio, un trasposone viene introdotto in un ceppo, e i ricercatori identificano gli individui nei quali la funzione di un gene di interesse viene inattivata. In molti casi la perdita di funzione avviene perché il trasposone si è inserito nel gene. Se questo si verifica, il DNA può essere isolato, digerito in frammenti, e clonato in vettori virali, per creare una libreria di DNA. La libreria viene poi analizzata usando un frammento di DNA marcato radioattivamente complementare al trasposone (una sonda), allo scopo di identificare i cloni nei quali si è inserito il trasposone. S9. Si potrebbe iniziare con l'assunzione che l'inattivazione di un gene oncosoppressore causi la crescita delle cellule cancerose. Se è questo il caso, si potrebbe iniziare con una linea cellulare umana normale e introdurre un trasposone. Il passaggio successivo sarebbe quello di identificare le cellule che sono diventate immortali. Questo può essere fatto identificando gli aggregati cellulari che hanno perso l'inibizione da contatto. Si potrebbe quindi coltivare queste cellule e costruire, a partire da queste, una libreria genomica di DNA. La libreria sarà poi vagliata usando il trasposone come sonda marcata. S10. Un trasposone crea un sito mutabile perché l escissione di un trasposone determina una rottura cromosomica se le due estremità non vengono ricongiunte. Dopo la rimozione dal suo locus originale (che determina la rottura cromosomica), esso può essere inserito in un nuovo locus. Potresti determinare questo evento, analizzando un ceppo nel quale si è verificata una rottura cromosomica nel primo locus. Potresti esaminare al microscopio numerose cellule con un cromosoma rotto e vedere se si è formato un nuovo locus. Questo nuovo locus corrisponderebbe al sito nel quale si è inserito il trasposone. Se è questo il caso, ci sarebbe una rottura cromosomica nel nuovo sito, che potrebbe venire osservata al microscopio. S11. Il primo passaggio è quello di iniettare il plasmide che porta l'elemento P e il gene rosy + negli embrioni omozigoti per l'allele recessivo rosy (cioè rosy rosy). Dopo che questi embrioni sono diventati moscerini adulti, questi vengono incrociati con moscerini rosy rosy. Analizza il colore degli occhi della progenie F 1. Se essi sono rossi, almeno una copia dell'elemento P è saltata nel cromosoma di questi moscerini. Possibilmente, l'elemento P è saltato in un gene coinvolto nello sviluppo delle ali. Tuttavia, a questo punto, questo tipo di moscerini avranno una copia normale del gene e una copia inattivata dall'elemento P. Se l'inattivazione del gene fosse ereditata come dominante, questi moscerini dovrebbero manifestare ali deformate. In alternativa (e con maggiore probabilità), tuttavia, l'inattivazione di una copia della maggior parte dei geni verrà ereditata come un carattere recessivo. Se si verifica questo, le ali dei moscerini con gli occhi rossi avranno un aspetto normale.

8 Per identificare questi geni recessivi, incrocia ogni individuo della progenie F 1 con occhi rossi (e ali normali) con moscerini rosy rosy. Circa ¼ della generazione F 2 dovrebbe avere occhi rossi (assumendo che un elemento P sia saltato nel genoma dei moscerini con occhi rossi). Incrocia tra loro gli individui della progenie F 2 con occhi rossi (derivanti da ogni singolo incrocio). Da questi incroci, ¼ dei moscerini della generazione F 3 dovrebbe avere occhi di colore rosato, ½ dovrebbe avere una copia dell'elemento P rosy + e occhi rossi, e ¼ dovrebbe essere omozigote per l'elemento P e avere occhi rossi. Se l'elemento P si è inserito in un gene necessario per lo sviluppo delle ali, ¼ della progenie dovrebbe avere ali deformate e occhi rossi. In questo modo, potresti identificare i geni che sono coinvolti nello sviluppo delle ali. Nota: questo esperimento richiede un grande lavoro! Dovrai identificare migliaia di moscerini con occhi rossi e allestire migliaia di incroci per identificare i pochi geni che svolgono un ruolo chiave nello sviluppo delle ali. Tuttavia, questo approccio ha permesso l'identificazione dei geni che svolgono un ruolo importante in molti aspetti dello sviluppo di Drosophila.