Metodi spettroscopici per le Biotecnologie

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1 AA Metodi spettroscopici per le Biotecnologie Spettroscopia di emissione UV-VIS Dott. Alfonso Zoleo

2 Spe$roscopia di Emissione Cosa succede ad una molecola portata in uno stato ele$ronico eccitato? Esistono diversi percorsi di diseccitazione: S 2 ISC A F Ph T 1 Processi radia8vi di emissione spontanea: Fluorescenza e Fosforescenza (emissione dell energia come fotone e ricaduta allo stato fondamentale) Processi non radia8vi di diseccitazione termica: trasferimento di energia ad altri gradi di libertà (vibrazioni, rotazioni, traslazioni) e/o ad altre molecole per collisione (solvente, quencher).

3 Spe$roscopia di Emissione Il «quenching» è il processo di trasferimento dell energia di eccitazione del cromoforo ad un altra molecola, il quencher, con cui il cromoforo collide : M* + Q M + Q* I processi cui è sogge$a la molecola in stato ele$ronico eccitato possono essere: - Fotofisici: cambia lo stato quan8co della molecola, cioè può cambiare la sua energia o il suo momento angolare, ma la molecola non cambia - Fotochimici: cambia la natura chimica della molecola Ad es.: M* M + hv Fotofisico: cambia solo l energia della molecola M* M a + M b Fotochimico: la molecola M si scinde per formare due specie M a e M b più piccole I processi di interesse spe$roscopico sono quelli fotofisici

4 Spe$roscopia di Emissione: Fluorescenza, Fosforescenza Consideriamo due soli sta8 ele$ronici: (stato fondamentale) ed (primo stato eccitato) Assorbimento: Emissione spontanea: coefficiente di assorbimento di Einstein coefficiente di emissione spontanea di Einstein Momento di dipolo di transizione tra gli sta8 ele$ronici I coefficien) di Einstein danno la probabilità per unità di tempo di una transizione, ovvero sono le costan) cine)che delle equazioni cine)che che regolano l assorbimento e l emissione spontanea

5 Equazione cine8ca dell assorbimento ne$o: 3 7 Esempio: In un secondo, due molecole passano da a per assorbimento di due fotoni. Nello stesso tempo, una molecola passa da a per emissione indo$a Bilancio ne,o: una molecola passa da a 4 6

6 Equazione cine8ca dell emissione spontanea: Emissione spontanea: il numero di molecole che nell unità di tempo passano da a per emissione spontanea di radiazione è proporzionale a N 1 (numero di molecole nello stato ). Il coefficiente di emissione spontanea è proporzionale al coefficiente di assorbimento indo$o: quindi, tanto più probabile è l assorbimento, tanto più probabile è l emissione spontanea. Inoltre, l emissione spontanea dipende fortemente dalla frequenza della radiazione emessa. Il processo è rilevante solo per frequenze del visibile o frequenze maggiori L emissione da uno stato di singole$o eccitato allo stato di singole$o fondamentale è de$a Fluorescenza

7 Regola di selezione sullo spin Due sta8 ele$ronici eccita8 possibili: di singole$o ( ) o di triple$o (T 1 ) π* n π π* π* n n π π S=0 S=0 S=1 T 1 Come nell assorbimento di radiazione, anche nell emissione spontanea la variazione di S deve essere zero: ΔS=0 Permessa T 1 «Proibita» Lo stato T 1 è ad energia più bassa di, perché nello stato di triple$o gli ele$roni stanno più lontani, quindi si respingono meno T 1

8 Fosforescenza Se un qualche processo popola lo stato T 1 a par8re da, le molecole nello stato T 1 possono eme$ere spontaneamente per tornare nello stato. Il processo è spin- proibito, quindi avviene lentamente per effe$o di deboli perturbazioni. L emissione spontanea dallo stato di triple$o T 1 è de$a fosforescenza T 1 fluorescenza fosforescenza

9 Des8no degli sta8 eccita8 Consideriamo adesso il processo di emissione includendo anche gli sta8 vibrazionali e le curve di energia potenziale 1) Il modo più semplice per portare le molecole nello stato è quello di fare assorbire radiazione alla lunghezza d onda di assorbimento. 2) Dopo l assorbimento, le molecole si trovano in vari livelli vibrazionali dello stato ele$ronico eccitato Assorbimento v =2 v =1 v =0

10 Des8no degli sta8 eccita8 3) Il processo successivo è il Rilassamento Vibrazionale (VR): è un processo molto veloce (10-12 s), nel quale le molecole che si trovano nei livelli vibrazionali eccita8 del singole$o ricadono al livello vibrazionale fondamentale (v =0) di. Non è un processo radia)vo: l energia è rilasciata come energia termica ad altri gradi di libertà o al solvente. Rilassamento vibrazionale

11 Fluorescenza 4) A questo punto possono avvenire vari fenomeni Fluorescenza: Emissione spontanea da v =0 di a vari livelli vibrazionali eccita8 di. Quindi ho un insieme di transizioni a varie energie, che determinano uno spe$ro con stru$ura vibrazionale nello spe$ro di fluorescenza

12 Fluorescenza Tu$e le transizioni in fluorescenza originano in v =0 di. Tu$avia, come nell assorbimento, esse terminano a vari livelli v dello stato, con una probabilità proporzionale aal quadrato del fa$ore di Franck- Condon (P=kS 2 ) con S: S = ψ dr ψ v ' = 0 Stavolta considero la funzione d onda vibrazionale fondamentale dello stato ele$ronico eccitato ( ) e le funzioni d onda vibrazionali eccitate dello stato ele$ronico fondamentale ( ) v

13 Fluorescenza E Spe$ro di Fluorescenza Come conseguenza, la stru$ura vibrazionale dello spe$ro di fluorescenza presenta la banda vibronica 0-0 ad energia più alta e le altre ad energia via via più bassa. La differenza tra due bande vibroniche successive mi dà la frequenza del modo di vibrazione dello stato eleironico fondamentale

14 Assorbimento- Fluorescenza Confrontiamo lo spettro di assorbimento e quello di fluorescenza di uno stesso cromoforo 1) Lo spettro di fluorescenza cade sempre a lunghezze d onda maggiori 2) La parte di spettro sovrapposta a quello di assorbimento è relativa alla transizione 0-0 3) Se lo spettro di assorbimento è dovuto unicamente alla -, è abbastanza simmetrico rispetto a quello di fluorescenza

15 Assorbimento- Fluorescenza Confrontiamo lo spettro di assorbimento e quello di fluorescenza di uno stesso cromoforo 4) Qualunque lunghezza d onda io scelga nello spettro di assorbimento per eccitare le molecole in, ottengo sempre lo stesso spettro di fluorescenza, perché VR porta sempre tutte le molecole in v =0 di! La fluorescenza parte sempre da v =0 di A 0-2 Mando fotoni alla lunghezza d onda per indurre la transizione vibronica 0-2 F VR

16 Assorbimen8 - S n Naturalmente, posso avere transizioni elettroniche in assorbimento anche verso stati elettronici eccitati ad energia maggiore di (purché usi fotoni di sufficiente energia). Anche in questo caso, in accordo con Franck-Condon, avrò una distribuzione di molecole nei vari stati vibrazionali eccitati di S 2 S 2 π* n π S 2 π* n π π* n π π* n π π* n π π* n π

17 Des8no degli sta8 S n Anche negli stati elettronici S n si ha rilassamento vibrazionale rapido allo stato vibrazionale fondamentale dello stato S n. Tuttavia, tutti gli stati elettronici S n hanno sempre il livello vibrazionale fondamentale che si sovrappone a livelli vibrazionali eccitati di S n-1. Nella figura, vediamo che il livello vibrazionale v=0 di S 2 si sovrappone ai livelli vibrazionali eccitati di S 2 S 2 S 2 VR CI Questa situazione rende molto probabile la conversione S 2, nella quale le molecole nello stato vibrazionale fondamentale dello stato elettronico S 2 passano a molecole vibrazionalmente eccitate dello stato elettronico (Conversione Interna, CI). Il processo CI avviene quasi senza variazione di energia, è solo una variazione di stato. Dallo stato vibrazionalmente eccitato di si ha poi rapido VR allo stato vibrazionale fondamentale di

18 Conversione interna La probabilità di conversione interna dipende, nuovamente, dalla sovrapposizione tra la funzione d onda vibrazionale fondamentale di S n e le funzioni vibrazionali eccitate di S n-1 S 2 S 2 CI molto probabile CI meno probabile Fra stati elettronici eccitati S n e S n-1, la conversione interna è sempre il processo favorito rispetto alla fluorescenza, poiché c è efficace sovrapposizione tra i loro livelli vibrazionali. Quindi la fluorescenza non può avere luogo da S n a (n>1), ma solo da a (REGOLA DI KASHA)

19 Conversione interna CI possibile CI impossibile, solo fluorescenza E possibile che anche lo stato abbia livelli vibrazionali sovrapposti con lo stato. In questo caso, è possibile la conversione interna. Se invece è separato da in modo da non avere livelli vibrazionali sovrapposti (cosa possibile solo fra e ), allora la fluorescenza è l unico processo possibile, in assenza di altri processi di diseccitazione diversi dalla conversione interna.

20 Assorbimento- emissione per spe$ri con transizioni - S n La forma dello spettro di fluorescenza è indipendente dalla λ ECC. Posso usare anche un assorbimento (eccitazione) da a S 2, la regola di Kasha dice che comunque la fluorescenza avverrà solo da Abs./ Em.!S 2! S 2 hν λ La fluorescenza, quindi, mi consente di identificare la transizione elettronica fondamentale ( - )!! S o

21 Esempio: la clorofilla a Spettro di fluorescenza: origina solo da Bande vibroniche 1 Spettro di assorbimento: varie transizioni elettroniche: quali bande sono vibroniche e quali transizioni elettroniche diverse? A Per confronto con la fluorescenza, ne deduco che: A è una transizione elettronica, e non una banda vibronica di 1. Ovviamente Bx e By sono a lunghezze d onda troppo corte per essere bande vibroniche di A o 1 Per vedere se una banda è vibronica, posso anche convertire le lunghezze d onda delle varie bande in numeri d onda: se due bande vicine distano non più di cm -1 appartengono probabilmente alla stessa struttura vibrazionale. Se sono >=10000 cm -1 appartengono a differenti bande elettroniche

22 Esempio: perilene e solfato di chinino Nel perilene in benzene, la simmetria tra fluorescenza e assorbimento suggerisce che tutte le bande che osservo nello spettro di assorbimento sono bande vibroniche della stessa transizione elettronica - Nel solfato di chinino in acqua acidulata, le differenze tra assorbimento e fluorescenza suggeriscono che la banda che osservo a lunghezze d onda minori è una transizione elettronica -S 2 e non una banda vibronica di -.

23 Conversione intersistema (ISC) π* n π π* n π T 1 S=0 S=1 T 1 Nello schema OM, uno stato elettronico eccitato presenta due elettroni su orbitali diversi: questi possono avere gli spin opposti (singoletto) o paralleli (tripletto) In generale, quindi, uno stato elettronico eccitato di singoletto ha sempre una controparte di tripletto. Usualmente, nello stato di tripletto gli elettroni sono più distanti (regola di Hund), il che causa una minore repulsione elettronica, e lo stato di tripletto è ad energia minore

24 Conversione intersistema (ISC) Subito dopo l assorbimento, le molecole si trovano nei livelli vibrazionali eccitati di. Se le curve di energia di T 1 e si incrociano, esisteranno dei livelli vibrazionali di T 1 accessibili da. La conversione da a T 1, però, comporta un cambiamento dello stato di spin da S=0 a S=1, cosa che è formalmente proibita. Tuttavia, l interazione tra il momento angolare di spin e il momento angolare orbitalico, chiamata interazione spin-orbita, è una perturbazione in grado di rendere debolmente permessa questa conversione singoletto-tripletto. T 1 T 1 Oltre all interazione spin-orbita, la probabilità di transizione dipende dalla sovrapposizione delle funzioni d onda vibrazionali di e T 1

25 Conversione intersistema (ISC) Quindi, la conversione intersistema (Inter System Crossing, ISC) è tanto più probabile quanto più: 1) È forte l interazione spin-orbita: questa cresce con la quarta potenza del numero atomico, per cui atomi più pesanti rendono la perturbazione più forte e il mutamento singoletto-tripletto probabile. 2) E lento il processo VR in : il processo VR è in competizione con l ISC; se è troppo veloce non ci sono abbastanza molecole che «saltino» in T 1 3) E elevata la sovrapposizione fra le funzioni d onda vibrazionali nel punto di incrocio T 1 - : come al solito, questo è legato al fattore di Franck-Condon. Maggiore è l overlap, maggiore è la probabilità di conversione

26 Fosforescenza Seguiamo adesso il destino delle molecole che hanno fatto ISC allo stato T 1 : VR T 1 T 1 Dopo rilassamento vibrazionale allo stato v =0 di T 1, le molecole possono cadere allo stato fondamentale per emissione. Si parla di fosforescenza. Il processo è formalmente proibito, perché comporta cambiamento dello spin, ma la stessa interazione spin-orbita che ha permesso il processo ISC rende possibile questa transizione radiativa. Di nuovo, da v =0 si cade in vari livelli vibrazionali eccitati di. Quindi lo spettro di fosforescenza presenta una struttura vibronica come lo spettro di fluorescenza.

27 Fosforescenza Benché l interazione spin-orbita renda possibile la fosforescenza, il processo è comunque poco probabile. Quindi, l emissione avviene in tempi molto più lunghi della fluorescenza. Tipicamente, intorno ai millisecondi (nella fluorescenza, nanosecondi). Comunque, alcune sostanze fosforescenti hanno tempi di emissione radiativa di ore! Luce emessa dal fosforo bianco in aria, dopo essere stato esposto alla luce I pigmenti fosforescenti che sono utilizzati nelle statuine e altri oggetti fosforescenti sono sali di metalli con elevato Z, per favorire l ISC. Il pigmento più comunemente usato è l alluminato di stronzio, che dà un emissione verde. La purezza di questi pigmenti è importante, perché le impurezze possono favorire processi competitivi di diseccitazione, con perdita di intensità di fosforescenza

28 Fosforescenza Interazione spin-orbita Momento angolare di spin Momento angolare orbitalico ξ Costante di accoppiamento spin-orbita: dipende da Z4 Esempio dell effetto «atomo pesante» Lo spettro del bromonaftonorbornene ha uno spettro di fosforescenza molto più intenso del naftonorbornene

29 DIAGRAMMA DI JABLONSKI Assorbimento Fluorescenza IC A F R ISC ISC Conversione interna Conversione intersistema ISC F T 1 In generale, i diversi percorsi di diseccitazione dallo stato S1 o superiore sono sempre presenti per tutte le molecole: ciò che cambia è la velocità (probabilità) di un processo rispetto ad un altro, in dipendenza dal tipo di molecola, dal solvente, dalla presenza di quencher, dalla temperatura Fosforescenza Rilassamento vibrazionale