Strumenti della Genetica Molecolare Umana (3) Capitoli 6-7-8

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Eduardo Carrara
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1 Strumenti della Genetica Molecolare Umana (3) Capitoli 6-7-8

2 Piccolo test: trova al differenza Gel 2 Gel 1 Gel 1. digestione DNA genomico Gel 2. Digestione inserto cloni genomici

3 BANCHE DI DNA RICOMBINANTE Collezione di cloni contente almeno una copia di ogni sequenza di DNA del genoma che si vuole clonare. Si distinguono in relazione al materiale che si vuole clonare in: - genomiche se si utilizza il DNA genomico totale di un organismo (particolarmente utilizzate nel Progetto Genoma Umano) - cromosomiche si usa come DNA da clonare il DNA di un cromosoma e si ottiene una libreria cromosoma-specifica - cdna/geniche si utilizza come acido nucleico da clonare il DNA ricavato da una serie di molecole di mrna per trascrizione inversa

4 1. Il DNA viene digerito parzialmente con opportuni enzimi di restrizione (in relazione al motivo e al vettore di clonaggio) 2. La scelta del vettore e cruciale (dipende dalla grandezza dei frammenti che si vogliono ottenere) 3. E importante definire la ridondanza o complessita (definita in termini di Genomi Equivalenti, GE) di una libreria BANCHE GENOMICHE Per una libreria di genomico umano con inserti di dimensioni medie di 40kb: 1GE = 3000 Mb (DNA totale)/ 40 kb (grandezza inserto medio) = cloni Se dopo clonaggio otterro cloni la libreria sara ridondante 4 volte IMPORTANTE PER EVIDENZIARE LE DUPLICAZIONI GENOMICHE 4. Quelle piu recentemente costruite, utilizzano i BAC o PAC come vettori di clonaggio (per indicare un BAC si indica il nome della plate e le coordinate nella plate. Es. 143(plate)b2(coordinate))

5 Sistemi di clonaggio progettati per l espressione genica Finora metodi per lo studio del genoma dal punto di vista strutturale, ma come si fa per studiare l espressione di un gene? Sono utilizzati gli stessi sistemi? NO! E NECESSARIO OPERARE UN CLONAGGIO DI ESPRESSIONE O UN REGOLARE CLONAGGIO? Ma ATTENZIONE alle proteine eterologhe!!!!

6 Saggio di una banca di cdna di espressione La banca di cdna riflette l attivita genica di quel tipo cellulare al momento in cui sono stati isolati gli mrna (mrna maturi!) Si possono confrontare le attivita geniche in diversi tipi cellulari dello stesso organismo o dello stesso tipo cellulare in momenti diversi (durante lo sviluppo ed il differenziamento) Il clone di cdna puo essere utilizzato per screenare librerie genomiche per ottenere un clone genomico del gene (con gli introni e tutto cio che non e presente nell mrna) COME SI TROVA IL CLONE CORRISPONDENTE AD UN GENE?

7 Banche di cdna Le molecole clonate, cdna, sono derivate da molecole di mrna (presenti in un dato momento in una popolazione di cellule) Le molecole di mrna estratte e purificate su colonna mediante catene oligo(dt) sono trattate con trascrittasi inversa per ottenere le sequenze di cdna mrna 5 Trascrittasi inversa + dntp AAAAA TTTTT 5 Appaiamento primer mrna cdna 5 AAAAA TTTTT 5 RNAsiH + DNApolI + DNA ligasi cdna 5 AAAAA TTTTT 5 I frammenti di RNA degradato sono i primer della nuova sintesi cdna cdna 5 AAAAA TTTTT 5 cdna a doppia elica

8 Ma le estremita sono inclonabili? E se nella molecola di cdna c e un sito di restrizione BamHI? Al posto del linker spesso si preferisce un adattatore di cui e nota la sequenza GATCCAGAC GTCTG ADATTATORE GTCTG CAGACCTAG ADATTATORE TRATTAMENTO CON LIGASI GATCCAGAC GTCTG GTCTG CAGACCTAG

9 CLONAGGIO DI ESPRESISONE E SCREENING Esistono diversi metodi per screenare la libreria di cdna, uno in particolare si adatta alla selezione di un clone di cdna che codifichi una particolare proteina. Si il cdna in un vettore di espressione in questo modo si induce l espressione del gene e se ne puo ricavare la proteina corrispondente. Promotore inducibile (in genere di origine batterica) Polylinker VETTORE Trascrizione Proteina estranea prodotta nella cellula batterica Promotore inducibile (in genere di origine batterica)

10 VETTORI DI ESPRESSIONE INDUCIBILE I plasmidi della serie pet-3 contengono il promotore del batteriofago T7. Sono utilizzati in ceppi di E. Coli geneticamente modificati che portano il gene per la RNApolimerasi del fago t7, posto sotto controllo trascrizionale inducibile del promotore lac.

11 COME SI TROVA IL CLONE CORRISPONDENTE AD UN GENE? Vettore di espressione cdna Trasformazione di E.coli con cloni di cdna in vettori di espressione Piastramento su terreno di crescita in cui il vettore e indotto ad aprimere la proteina Stampa su membrana Lavaggio dall eccesso di anticorpo Autoradiografia per evidenziare i cloni positivi Ibridazione con anticorpo marcato che interagisce solo con le proteine prodotte per cui c e una specifica interazione 1. Si deve possedere un anticorpo per la proteina 2. Marcare l anticorpo 3. Screenare la libreria di espressione con l anticorpo marcato

12 PCR schema denaturazione Primers antisenso senso annealing Sintesi del DNA fra i primers Denaturazione e annealing Sintesi del DNA fra i primers molecole dopo 2 cicli Dopo 30 cicli ci sono piu di 10 9 molecole della sequenza di interesse 12

sequence that has a single occurrence in the genome and whose location and base

13 Gel di agarosio post amplificazione Cosa stiamo vedendo??? A sequence-tagged site (or STS) is a short (200 to 500 base pair) DNA sequence that has a single occurrence in the genome and whose location and base sequence are known. STSs can be easily detected by the polymerase chain reaction (PCR) using specific primers.

La stringenza di una PCR Anche la PCR come le ibridazioni puo essere vincolata dalla stringenza che in questo caso e definita dalla capacita dei primer di legarsi al DNA target.

14 La stringenza di una PCR Anche la PCR come le ibridazioni puo essere vincolata dalla stringenza che in questo caso e definita dalla capacita dei primer di legarsi al DNA target. In questo caso la temperatura e il principale fattore influenzante la stringenza e quindi specificita della reazione di PCR. Alte temperature implicano maggiore stringenza, basse temperature minore stringenza. A parita di temperatura e possibile avere piu bande... come mai? I primer possono legarsi oltre che al sito per i quali sono stati diseganti anche a minore efficienza in altri loci del genoma e cio comporta che la PCR abbia bande aggiuntive e non sia specifica.

15 PCR per la ricerca di delezioni (ΔF508) PCR di una regione di 100pb che comprende la sequenza deleta e corsa su gel di poliacrilammide controllo ΔF508/ ++ ΔF508/+ ΔF508 ΔF508 15

16 PCR nella tipizzazione dei polimorfismi dei siti di restrizione questo metodo identifica anche SNPs (single nucleotide polymorfisms)

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