QUANTI MECCANISMI DI REGOLAZIONE DELL ESPRESSIONE GENICA ESISTONO?

Transcript

1

2 QUANTI MECCANISMI DI REGOLAZIONE DELL ESPRESSIONE GENICA ESISTONO? L espressione genica nei procarioti e negli eucarioti e regolata a vari livelli: -Trascrizionale - Emivita dell RNA -Traduzionale - durante la maturazione dell mrna - Post-traduzionale

3

4 Nei genomi batterici si distinguono: -Geni strutturali, che codificano per proteine o enzimi -Geni/Sequenze regolatrici, sono geni che codificano per proteine che regolano l attivita di altri geni o sequenze a cui si legano le proteine regolatrici Il gene regolatore puo regolare la trascrizione in modo positivo (on) o negativo (off)

5 Geni strutturali trans-agenti Geni Regolatori trans-agenti Sequenze regolatrici cis-agenti (promotori, terminatori, operatori)

6 I GENI STRUTTURALI POSSONO ESSERE: Geni costitutivi (housekeeping) mantengono le funzioni essenziali della cellula Geni inducibili Espressi in certe condizioni ambientali o dello sviluppo,regolati Generalmente i geni procariotici sono organizzati in clusters, negli eucarioti sono individuali. La clusterizzazione ne permette un controllo coordinato a partire da un unico promotore

7 NEI BATTERI I geni clusterizzati sono in genere enzimi dello stessa via catabolica o anabolica Le proteine sono prodotte a partire da un unico mrna policistronico

8 GENI INDUCIBILI INDOTTI POSITIVAMENTE (proteine regolatrici che permettono alla RNA polimerasi di posizionarsi sul promotore ed iniziare la trascrizione) INDOTTI NEGATIVAMENTE (proteine regolatrici che bloccano la trascrizione a partire dal promotore)

9 La regolazione dell espressione genica puo essere regolata positivamente e negativamente Corepressori e induttori Molecole effettrici, aminoacidi, zuccheri, metaboliti

10 E.Coli metabolizza preferibilmente il glucosio In assenza di glucosio metabolizza altri carboidrati, come il lattosio, spendendo considerevole quantita di energia Accensione o Induzione dei geni del lattosio

11 Il glucosio e importato attraverso il sistema Pts, che blocca la Lac Permeasi. Quando non c e glucosio la Lac Permeasi e attiva

12

13 OPERONE Lac:Inducibile regolato in modo negativo Stato non indotto Operone lac ha bassa attivita basale

14 OPERONE Sequenza di DNA che comprende operatore, promotore e geni strutturali Singolo mrna che porta l informazione dell intero operone, codifica per diversi geni contemporaneamente

15

16

17 Operone Lac : controllo negativo con induzione Induttore=> beta-galattoside, attivano la trascrizione di piu di 1000 volte rispetto alle condizioni basali, dopo pochi minuti dalla loro immissione. Mutazioni nel circuito regolatore possono sia abolire l espressione dei geni beta-gal sia genrare un espressione non regolata

18 Mutanti -cis-agenti -trans-agenti

19 IL GENE I -Analisi genetiche hanno contribuito a chiarire ulteriormente il funzionamento del circuito di controllo -L analisi dei mutanti per il gene I fa meglio comprendere la funzione di tale gene mutanti I-, sintetizzano livelli massimi di enzimi sia in presenza che in assenza di induttori. Mutanti costitutivi. Questi mutanti avevano mutazioni che mappavano adiacenti ai geni Z,Y,A. Da qui si identifio il locus I. Ciò significa che i mutanti I- producono una proteina repressore difettiva per il riconoscimento delle sequenze dell operatore O: l Rna polimerasi non incontra alcuno ostacolo e può trascrivere i geni lac anche in assenza di substrato mutante Is, non producono mai enzimi per il lattosio, né in presenza, né in assenza di induttori. Questo fa pensare a una proteina repressore difettiva per il sito di legame con le molecole del lattosio e dei suoi derivati: il repressore resta sempre legato alla sequenza O e la trascrizione dei geni strutturali non può avvenire.

20 Natura del locus I determinata in seguito all analisi dei diploidi parziali: mutanti I-/I+

21 Mutanti Is:diploide I+/IS

22 Mutanti nel sito di legame del DNA, per cui si formano tetrameri misti nel parziale diploide, di proteine attive e inattive

23

24 Induttore: Allolattosio, che origina dal lattosio per azione della beta-galattosidasi

25 Mutanti O c Furono identificati mutanti costitutivi simili a I- ma che non mappano nel locus I Esprimono costitutivamente i prodotti dell operone Lac Tramite mappatura si e identificato il locus O fra i loci I e Z Diploide parziale recessivo

26 L assenza di lattosio fa scendere i livelli degli enzimi lac solo del10 %

27

28 IL PROMOTORE DI Lac E FORMATO DA 2 COMPONENTI SEPARATE=>mutazioni nel promotore sono cis-agenti O CAP PROTEINA CHE SI ATTIVA IN PRESENZA DEL CATABOLITA

29 REPRESSIONE DA CATABOLITA:controllo positivo con attivatore Devono essere bassi i livelli di glucosio

30 AMP ciclico Inibisce l attivita dell adenilato ciclasi CAP si lega al promotore e attiva la RNA polimerasi O CAP

31

32 In presenza di Glucosio la proteina CAP o CRP non si attiva e la RNApolimerasi non si lega al promotore I GENI DELL OPERONE Lac SONO MANTENUTI AD UN ATTIVITA DEL 2% RISPETTO ALLE CONDIZIONI DI MASSIMA ATTIVAZIONE

33

34

35 ACIDO CORISMICO TRIPTOFANO Sequenza leader

36 CONTROLLO A 2 LIVELLI: REPRESSIONE NEGATIVA ATTENUAZIONE

37 REPRESSIONE NEGATIVA ATTIVAZIONE DI 70X

38 MUTANTI trpr Questi mutanti hanno il repressore inattivo, quindi non puo bloccare la sintesi degli enzimi anche in presenza di triptofano. Tuttavia gli enzimi del Trp non vengono prodotti ai massimi levelli ma con un decremento di 10 volte, in presenza di triptofano

39 NEI MUTANTI TrpR,CHE MANCANO DI REPRESSORE FUNZIONALE, IL LIVELLO DI SINTESI DEGLI ENZIMI DEL TRIPTOFANO E COMUNQUE RIDOTTO DI CIRCA 10 VOLTE DOPO L AGGIUNTA DI TRIPTOFANO ATTENUAZIONE

40 Regione simile ad un terminatore La traduzione avviene in contemporanea alla trascrizione

41 Attraverso l analisi di mutanti che producono alti livelli di enzimi Trp in presenza di Triptofano si e identificata una regione con delezione tra l operatore e il gene trpe=> Sequenziamento della regione leader La sequenza leader viene sempre trascitta ad alti livelli, anche nei genotipi wild-type, in presenza di alte concentrazioni di Trp

42 Il sequenziamento della regione leader ha portato alla scoperta di strutture appaiabili a forcina Forcina di terminazione

43 Nel peptide leader ci sono 2 residui contigui di triptofano, un codone d inizio e uno di terminazione della traduzione

44

45

46 Forcina di terminazione della trascrizione

47 OPERONE DELL ARABINOSIO: DOPPIO CONTROLLO POSITIVO E NEGATIVO RNApolimerasi A IN PRESENZA DELL ARABINOSIO arabinosio B ATTIVAZIONE DELLA TRASCRIZIONE

48 Duplice funzione della proteina arac La proteina arac assume una conformazione differente e reprime l operone ara legandosi sia ad arai che ad arao