Talassemie Fibrosi Cistica

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1 MODULO DI GENETICA a.a Talassemie Fibrosi Cistica Cristina Bombieri

2 DISTURBI EREDITARI DELL'EMOGLOBINA **** TALASSEMIE

3 Bianco e Silvestroni nel loro laboratorio di Roma. (Nat Rev Genet 2004; 5, ) Antonio Cao Università di Cagliari

4 Identificazione di geni responsabili di malattie mendeliane IERI OGGI HGP (Human Genome Project) & Exome sequencing (es. Talassemie) (es. Fibrosi Cistica) (Gelehrter, Collins, Ginsburg; Genetica Medica; Masson 1999) (ri-sequenziamento regioni codificanti)

5 L emoglobina α2 β2 α1 β1 Struttura della molecola

6 Classe β β γ δ ε Classe α α ζ (Purves, Savada, Orians, Heller; Biologia L'informazione e l'eredità; Zanichelli, 2005)

7 (ca 30 Kb) (ca 60 Kb) (lunghezzza media aminoacidi)

8 Ontogenesi emoglobina L'ordine dei geni in ogni cluster corrisponde all'ordine della loro espressione durante lo sviluppo (Thompson and Thompson, Genetica in Medicina, Idelson-Gnocchi, 2005)

9 EVOLUZIONE SUPERFAMIGLIA DELLE GLOBINE NEI VERTEBRATI catene globiniche mostrano una forte omologia di sequenza ad indicare una loro origine evolutiva comune T.Strachan and A.Read - Genetica umana molecolare I ed. italiana (IV ed USA) Zanichelli 2012

10 GENI OMOLOGHI: ORTOLOGHI E PARALOGHI T.Strachan and A.Read - Genetica umana molecolare I ed. italiana (IV ed USA) Zanichelli 2012

11 DIVERGENZA FUNZIONALE DEI GENI DUPLICATI: ORIGINE DI GENI PARALOGHI Mutazione nella regione codificante di una delle due copie e acquisizione di una nuova funzione Mutazioni in regioni regolatrici di entrambe le copie: profili di espressione differiscono (espressione avviene in cellule, tessuti o stadi di sviluppo diversi) nei due geni figli T.Strachan and A.Read - Genetica umana molecolare I ed. italiana (IV ed USA) Zanichelli 2012

12 Disturbi ereditari dell emoglobina Varianti strutturali (difetti QUALITATIVI): emoglobina S (An. Falciforme), emoglobina C, >200 varianti rare 1,5: marcatore peso molecolare 2: adulto normale 3: neonato normale 4: omozigote HbS, An. Falciforme 6,8: eterozigote HbS, portatore 7: eterozigote composto HbS/HbC ( hemoglobin-myoglobin.html) FALCEMIA (HbS): Glu6Val; GAG > GTG HbC: Glu6Lys; GAG > AAG Le prime malattie molecolari descritte -> Genetica Medica (Weatherall, Nat Rev Genet 2004; 5:625)

13 Disturbi ereditari dell emoglobina DIFETTI QUALITATIVI (Varianti Strutturali) Es. HbS, Falcemia DIFETTI QUANTITATIVI Talassemie: α, β, δβ, δ, εγδβ HPFH: Persistenza ereditaria di emoglobina fetale (α2γ2) Le prime malattie molecolari descritte -> Genetica Medica (Weatherall, Nat Rev Genet 2004; 5:625)

14 P. Turnpenny & S. Ellard. Emery's Elements of Medical Genetics. Elsevier ChurchillLivingstone, 12th ed., 2005

15 Talassemie: alterato rapporto catene α/nonα α, β = sintesi assente α+, β+ = ridotta sintesi Anemia con microcitemia e riduzione numero e dimensioni dei globuli rossi (Gelehrter, Collins, Ginsburg; Genetica Medica; Masson 1999)

16 Talassemie: terminologia clinica Major (maggiore), Grave, Trasfusione dipendente es. Morbo di Cooley (Thal β0); Idrope fetale (Thal α0); Intermedia, non trasfusione dipendente; es. Thal β+ con mutazioni lievi che conservano consistente produzione residua di catene beta Thal β+ / Thal α Thal β + Mut γ (HPFH) Minor (minore): portatore, non affetto, microcitemico.

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18 α Talassemia Malattia da HbH (α-/--; talassemia intermedia): Anemia piuttosto marcata; quadro clinico non è estremamente grave Idrope fetale (--/--; talassemia major); tessuti anossici, scompenso cardiaco, edema pervade tutti i tessuti. Letale per il feto o subito dopo la nascita.

19 Delezione di geni α in seguito a crossing over ineguale (Thompson and Thompson, Genetica in Medicina, Idelson-Gnocchi, 2005)

20 Distribuzione mondiale della alfa-talassemia

21 β Talassemia Anemia Mediterranea perchè diffusa più frequentemente nei paesi del Mediterraneo: Nord-Africa, Medio-Oriente, India, Asia centrale e sudest Asiatico. Ridotta o assente sintesi di catene β Eterogena dal punto di vista molecolare Identificate >200 mutazioni che producono il fenotipo talassemico (sostituzioni nucleotidiche, piccole inserzioni o delezioni; meno frequenti le grosse delezioni): Mutazioni β0 : Causano assenza totale di produzione delle catene β Mutazioni β+: Causano riduzioni più o meno marcate nella produzione delle catene β

22 Incidenza β Talassemia circa 1% popolazione mondiale portatore di β-talassemia (ca individui) Affetti circa Italia: affetti Regioni più colpite: Sardegna, Sicilia e Delta Po. Sardegna regione con più alta incidenza: circa 1000 affetti e frequenza portatori 11%.

23 Patofisiologia della beta-talassemia Ridotta o assente sintesi di catenedi classe β Eccesso catene α Catene α non formano tetrameri, ma si legano alla membrana dei GR e dei precursori danneggiandola, ad alte concentrazioni formano aggregati tossici β 0/β 0 - TALASSEMIA MAJOR (MORBO O ANEMIA DI COOLEY) Si manifesta in genere entro i primi due anni di vita. Eritropoiesi inefficiente, anemia, ipertrofia del tessuto ematopoietico con deformazioni scheletriche, ipertrofia del fegato e della milza che si riattivano come organi ematopoietici Talassemia major + HPFH forma fetale persistente α2γ2 (Hb F) attenuazione fenotipo β talassemico β 0/β + o β +/β + TALASSEMIA INTERMEDIA Quadro clinico più attenuato che compare nell'infanzia o anche più tardi, con anemia lieve o moderata, talvolta ritardi nella crescita e anomalie ossee. Eterozigote β 0/+ o β +/+ TALASSEMIA MINOR: portatore sano o oligosintomatico; microcitemico

24 COMPLICANZE DA TALASSEMIA MAJOR NON CURATA

25 Mutazioni comuni per la betatalassemia in Sardegna β 6 (-A) β 39 (C>T) GAG (Glu) G-G (95.7%). Gene normale CAG (Gln). β 39 UAG (stop) FRAMESHIFT (90%) Mutazione IVS1-110G>A (β+) (Thompson and Thompson, Genetica in Medicina, Idelson-Gnocchi, 2005)

26 Mutazioni comuni per la betatalassemia in Sardegna β 6 (-A) β 39 (C>T) GAG (Glu) G-G (95.7%). Gene normale CAG (Gln). β 39 UAG (stop) FRAMESHIFT ETEROGENEITÀ' (90%) GENETICA, ALLELICA: Alleli multipli allo stesso locus genico Mutazione IVS1-110G>A (β+) (Thompson and Thompson, Genetica in Medicina, Idelson-Gnocchi, 2005)

27 Mutazioni comuni per la betatalassemia in Sardegna β 39 (C>T) Talassemia (95.7%) Major,. Gene normale CAG (Gln)forma grave. β 39 UAG (stop) β 6 (-A) GAG (Glu) G-G FRAMESHIFT (90%) Talassemia intermedia, forma lieve Mutazione IVS1-110G>A (β+) (Thompson and Thompson, Genetica in Medicina, Idelson-Gnocchi, 2005)

28 Mutazioni comuni per la betatalassemia in Sardegna β 39 (C>T) Talassemia (95.7%) Major,. Gene normale CAG (Gln)forma grave. β 39 UAG (stop) β 6 (-A) GAG (Glu) G-G FRAMESHIFT Variabilità espressione (90%) Talassemia intermedia, forma lieve fenotipica RELAZIONE GENOTIPO-FENOTIPO ORDINE DI DOMINANZA DEGLI ALLELI: wt > β + > β 0 Mutazione IVS1-110G>A (β+) (Thompson and Thompson, Genetica in Medicina, Idelson-Gnocchi, 2005)

29 ETEROGENEITÀ CLINICA (FENOTIPICA): mutazioni a carico dello stesso gene possono causare malattie distinte Gene HBB (beta-globina) CCT GAG GAA pro GLU glu CCT GtG GAA pro VAL glu ANEMIA FALCIFORME BetaTALASSEMIA CCT G-G G AA pro gly-fs

30 PLEIOTROPIA: mutazione in un gene può avere più di un effetto fenotipico distinto nello stesso organismo

31 Delezioni geni gruppo beta globinici

32 Emoglobina Lepore (asintomatico) (β-talassemia intermedia) (Thompson and Thompson, Genetica in Medicina, Idelson-Gnocchi, 2005)

33 Distribuzione mondiale delle mutazioni della beta-talassemia

34 Colocalizzazione di malaria e alcune emoglobinopatie MALARIA TALASSEMIA (Fantoni et al. Biologia Cellulare e Genetica Ed. Piccin 2009)

35 Incidenza della β talassemia in Italia E indicata la frequenza degli eterozigoti Bodmer e Cavalli, Genetica Evoluzione Uomo, vol2, Mondadori

36 Frequenza di diverse mutazioni per la β talassemia in Italia Bianco Silvestroni; Le Talasemie; Ist It Med Sociale, 1998

37 Diminuzione dei nati con Talassemia in Sardegna Programma di screening dei portatori iniziato nel 1975 (Cao, Am J Hum Genet, 54:397; 1994)

38 Genotipo-Fenotipo in Talassemia e An. Falciforme a-talassemia Fa ia r tto m i al t en i b B-talassemia O An. Falciforme Variabilità fenotipo HPHF Geni modificatori BCL11A HBS1L-MYB (HFE?)... beta-talassemia e Anemia Falciforme mostrano una ampia variabilità fenotipica (= gravità manifestazioni cliniche), non sempre riconducibile alle mutazioni a carico del gene bglobinico

39 FIBROSI CISTICA

40 Gli organi colpiti dalla FC Vie aeree: ostruzione e infezione, cause della maggior parte dei decessi Pancreas: occlusione dotti e insufficienti enzimi digestivi in 85% dei pazienti Intestino: occlusione fecale in 10% dei neonati Apparato riproduttivo: 95% dei maschi assenza dotti deferenti. Possibile tappo mucoso uterino Ghiandola sudoripara: eccesso di cloro nel sudore, test diagnostico fondamentale (Cummings Eredità EdiSES, 2004)

41 Fibrosi Cistica Più comune malattia AR nelle popolazioni di origine caucasica (molto rara nelle altre popolazioni) Nati/anno Italia: oltre 200 Affetti circa (40% adulti) Portatori: oltre (Nota: estrapolazioni dai dati di screening neonatale nel Veneto-Trentino Alto Adige: incidenza osservata FC=1/2705 nati, frequenza dedotta portatori = 1/26,5) Sopravvivenza: mediana 30 anni (> 60 anni per alcuni pazienti) Legge prevenzione e cura FC (screening e DPN)

42 Incidenza della fibrosi cistica in diversi gruppi etnici: INCIDENZA (alla nascita) = numero casi FC / totale dei nati vivi Può variare anche di molto tra diversi gruppi etnici presenti in uno stesso paese (Lancet 373: ;2009). Europa (Finlandia America (caucasici) Afro-Americani Ispano-americani Asiatico-americani. 1/ /15000) 1/3300 1/ / /32100

43 Identificazione del gene CFTR mediante clonaggio posizionale

44 Clonaggio di posizione per la identificazione del gene della fibrosi cistica 600 Kb MetH marker 950 Kb IRP gene candidato scartato J3.11 marker gene CF 1985: linkage al cromosoma : errata identificazione del gene 1989: identificazione del gene CFTR (Science 245: 1059, 1989)

45 Il gene e la proteina CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator) Cromosoma: 7q31 Gene: 200 kb 27 esoni mrna: 6129 bp Proteina: 1480 aminoacidi, (

46 Normal CF H2O Cl- Cl- Cl- H2O Cl-

47 FC e mutazioni note >1600 mutazioni; non tutte patologiche, di molte non si conosce il significato funzionale (alcune molto dubbie) Vario tipo: puntiformi, piccole del/ins, grossi riarrangiamenti,... Differente distribuzione geografica delle mutazioni (molte sono popolazione-specifiche) Non è stato identificato il 100% delle mutazioni patologiche (6098% secondo la popolazione) Poche decine di mutazioni frequenti: F508del 35-90% altre <20% circa; >parte hanno freq. <1%

48 Distribuzione mutazioni FC (Zielenski e Tsui, Ann Rev Genetics 29: 783, 1995).

49 Le mutazioni più frequenti della Fibrosi Cistica F508 G542X G551D W1282X N1303K R553X Mondo (%) Italia (%) Veneto (%) CF Mutation Database:

50 Mutazioni CF in Veneto e Trentino AA Mutazione F508 R1162X 2183AA->G N1303K G542X, 711+5G->A G->A G85E, R553X, altre2 Altre 5 Totale (16 mutazioni) Hum. Genet. 1995; 95:397 Frequenza % 47,6 9,8 9,3 4,0 2,7 2,2 1,3 Freq. Cumulativa % 47,6 57,3 66,7 70,7 76,0 78,2 83,6 0,9 e 0,4 86,7 86,7

51 Rischio residuo dopo analisi negativa di mutazione per Fibrosi Cistica Mutazioni identificate Rischio di essere portatore ccr Rischio di avere un figlio affetto; un genitore negativo ¼ ccr Rischio di avere un figlio affetto; due genitori negativi ( ¼ ccr)2 (d) 0 (1/26,5) n.a. (1/2705) 86,7% 1/193 1/772 1/ % 100% 1/ / / ccr=2pq(1-d)/2pq(1-d)2; ( ) = dati screening neonatale Veneto-Trentino

52 RISCHIO DI PORTATORE Gruppo etnico* Ebrei-Ashkenazi Europei-caucasici Ispano-americani Afro-americani Asiatico-americani Detection rate Carrier Risk (NO test mut) Carrier Risk (test mut neg**) 97% 80% 57% 69% ++ 1/29 1/29 1/46 1/65 1/90 1/930 1/140 1/105 1/ *POPOLAZIONE AMERICANA **Pannello mutazioni consigliato da ACMG; storia familiare negativa per CF

53 Identificazione delle coppie a rischio di Fibrosi Cistica con analisi di mutazioni Mutazioni due genitori un genitore identificate con mutazione negativo (d) (d)2 2d(1-d) due genitori negativi (1-d) % 70% 49% 42% 9% 86.7% 75.2% 23.0% 1.8% 95% 100% 90.2% 100% 9.5% 0 0.3% 0

54 Rischio di avere figli affetti Gruppo etnico di entrambi i partner NO TEST P1 neg P2 no test P1 pos P1 + Partners P2 neg P2 no entrambi negativi test Ebrei-Ashkenazi Europei-caucasici Ispano-americani Afro-americani Asiatico-americani 1/ / /3720 1/116 1/ / / /560 1/116 1/ / / /420 1/824 1/ / / /828 1/260 1/ / / Rischio figlio affetto = ¼ x rischio carrier P1 x rischio carrier P2 P1 e P2 carrier => rischio figlio affetto = 1/4

55 Classificazione delle mutazioni del gene della Fibrosi Cistica Difetto risultante Sintesi Assente Maturazione Regolazione Conduzione Quantità assente alterata alterata ridotta Le mutazioni della fibrosi cistica (gene CFTR) sono state suddivise in 5 classi in base al loro effetto funzionale (Modificato da Zielenski e Tsui, Ann Rev Genetics 29: 796, 1995).

56 Correlazione fra genotipo e funzionalità pancreatica esocrina Funzione Tipo di mutazioni Esempi Insufficienza Grave/Grave F508 / F508 F508 / R1162X Sufficienza Grave/Lieve Lieve/Lieve F508 / R117H-5T KbC-T / R334W

57 Mutazioni CFTR e CF I148T o 3199del6: qual è la vera mutazione? R117H-7T e R117H-5T Alleli complessi: F508del-R553Q

58 Note 75-95% mutazioni CF: dove sono le altre mutazioni CF? mutazioni non identificabili con i metodi correnti (es. grossi riarrangiamenti) mutazioni in zone solitamente non indagate (introni, promotori) mutazione in zone di regolazione lontane dal gene (es. lattasi) altri meccanismi mutazionali (vedi caso mut. dinamiche) mutazioni apparentemente neutrali (ESE) altri geni?

59 Complessità in una malattia monogenica La fibrosi cistica presenta un'ampia variabilità nella gravità dell espressione clinica (configurazione, gravità, età di insorgenza) in particolare delle manifestazioni polmonari, anche tra pazienti con le stesse mutazioni CFTR o addirittura appartenenti alla stessa famiglia

60 Cosa può spiegare le modificazioni del fenotipo? eteogeneità allelica, ma solo parzialmente modulazione di un secondo sito nello stesso gene F508del (grave); F508del-R553Q (gravità minore) R117H-IVS8_5T (FC); R117H-IVS8_7T (nonfc) splicing alternativi o anomali altri meccanismi mutazionali controlli epigenetici Fattori ambientali (es. infezioni) Mutazioni in altri geni (Geni Modificatori)

61 Complessità in una malattia monogenica: Geni modificatori Impossibile predire fenotipo CF in base alle sole mutazioni CFTR Variabilità nella gravità dell espressione clinica della malattia si ha anche tra pazienti con lo stesso genotipo CFTR o addirittura appartenenti alla stessa famiglia Queste osservazioni suggeriscono l esistenza di altri geni che modulando l espressione di CFTR o interferendo con percorsi metabolici comuni altererebbero il quadro clinico in FC Gene CFTR + molti altri geni -> una malattia

62 Geni Candidati regolazione dell equilibrio rimodellamento tissutale proteasi-antiproteasi difesa dell'ospite / infezioni infiammazione stress ossidativo e del metabolismo degli xenobiotici e del altri trasportatori e proteine che interagiscono con CFTR (canali epiteliali del sodio, ENaC; canali del cloro, ORCC; scambiatore Na/H, NHE) controllo di espressione genica, processamento proteina, altri canali ionici epiteliali, controllo produzione muco, clearance mucociliare (es. chaperonine come HSP70, calnexina, CHIP, sembra partecipino attivamente a sintesi e degradazione di CFTR)

63 CF e geni modificatori IFRD1 11p13 20q13.2 EHF/APIP? 2002;3: Studio dei geni modificatori con la stessa strategia usata per le malattie complesse GWAS

64 Fenotipi CFTR-relati un gene -> molte malattie = entità cliniche associate a disfunzioni del gene CFTR, che tuttavia non soddisfano i criteri diagnostici standard per FC organo colpito polmone pancreas v. deferenti CAVD / AZOOSPERMIA OSTRUTTIVA PANCREATITE IDIOPATICA BRONCHIETTASIE DIFFUSE + - -

65 Complessità in una malattia monogenica: fenotipicf-relati (CFTR-patie) CAVD (assenza congenita vasi deferenti)/azoospermia ostruttiva: 80% almeno 1 mutazione 50-60% 2 mutazioni pancreatite: 30% almeno 1 mutazione 10-15% 2 mutazioni bronchiettasie: 10-50% almeno 1 mutazione > mutazioni CF-lievi o non causa di CF; no mutazioni specifiche un gene -> molte malattie

66 Trascritti CFTR e fenotipi correlati % mrna CFTR normale 100% Fenotipo Normale Normale azoospermia azoospermiaostruttiva ostruttiva bronchiectasie bronchiectasiediffuse diffuse aspergillosi aspergillosipolmonare polmonare pancreatite pancreatitecronica cronica poliposi poliposinasale nasale rinosinusite rinosinusitecronica cronica 0% (Estivill; Nat Genet 12:346; 1996) Genotipo CFTR N/N N / 5T N / CFl N / CF 5T / 5T CFl / 5T CF / 5T CFl / CFl CF(fibrosi CF(fibrosicistica)-PS cistica)-ps CF CFad adesordio esordiotardivo tardivo CF / CFl CF CF(fibrosi (fibrosicistica)-pi cistica)-pi CF / CF

67 nessun gene è un'isola

68 Malattie Genetiche