FRUTTO DI PESCO: COMPRENDERE COME CRESCE PER MIGLIORARNE LA QUALITA

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1 FRUTTO DI PESCO: COMPRENDERE COME CRESCE PER MIGLIORARNE LA QUALITA Brunella Morandi, Pasquale Losciale, Luigi Manfrini, Marco Zibordi e Luca Corelli Grappadelli Dipartimento Colture Arboree Università di Bologna La crescita di un frutto è il complesso risultato di eventi biochimici e biofisici che permettono l accumulo di acqua e sostanza secca nei suoi tessuti. Le regole a cui questo meccanismo risponde sono determinate geneticamente e possono variare molto a seconda della specie. Nonostante questo, diversi fattori come lo stato fisiologico dell albero e le condizioni ambientali possono influenzare fortemente la dinamica di accrescimento di un frutto, sia su base giornaliera che stagionale, con ripercussioni significative sulle caratteristiche qualitative alla raccolta. La comprensione di questi meccanismi, e dei vari fattori colturali ed ambientali che li influenzano è quindi fondamentale per indirizzare la gestione del processo produttivo verso l ottenimento dei caratteri quali-quantitativi desiderati. FLUSSI VASCOLARI E TRASPIRAZIONE CUTICOLARE L acqua e gli assimilati vengono traslocati verso il frutto attraverso i flussi di floema e xilema, ma una parte dell acqua importata dal frutto viene persa per traspirazione dalla cuticola. Mentre lo xilema trasporta principalmente acqua e sali minerali, oltre che ormoni ed altre sostanze, il floema è deputato alla traslocazione del carbonio assimilato durante il processo fotosintetico. Questo si presenta sotto forma di carboidrati il cui tipo e la cui quantità possono variare molto a seconda della specie. Melo e pesco, ad esempio, traslocano sia sorbitolo che saccarosio (Moing, 1992; Beruter, 1985), mentre nel floema dell Actinidia troviamo soltanto saccarosio. All interno dei fasci vascolari, floema e xilema si muovono secondo gradienti di potenziale idrico (Münch, 1930; Patrick, 1997); in questo modo, maggiore è la differenze di potenziale idrico tra due punti lungo la via di traslocazione, maggiore sarà la velocità del flusso tra questi due punti. Il tasso di traspirazione di un frutto dipende invece dalla conduttanza di superficie della cuticola, ossia dal suo grado di permeabilità al vapore acqueo, e dalle condizioni ambientali. La conduttanza di superficie della cuticola può variare durante lo sviluppo del frutto ma rimane una caratteristica geneticamente determinata per ogni specie. Al contrario, le fluttuazioni giornaliere di temperatura ed umidità relativa influenzano fortemente la traspirazione nel breve periodo (Lescourret et al., 2001; Wu et al., 2003). All inizio del suo sviluppo, il frutto di pesco è caratterizzato da un altissima conduttanza di superficie, che decresce lungo la stagione, pur mantenendo valori molto alti rispetto ad altre specie 1

2 (Gibert et al., 2005). L alta conduttanza di superficie determina alti tassi di traspirazione, e quindi ingenti perdite idriche durante tutta la stagione. Sia in fase di divisione che di espansione cellulare, l acqua persa da una pesca per traspirazione rappresenta circa il 50-60% dell apporto totale giornaliero di materia fresca. Di questi importi, circa il 30% proviene dal floema, mentre il restante 70% entra per via xilematica (Morandi et al., 2007a) (Tabella 1). IL FRUTTO E LA SUA GIORNATA Recentemente il gruppo di Ecofisiologia del Dipartimento di Colture Arboree dell Università di Bologna ha sviluppato strumenti a basso costo capaci di monitorare in continuo ed in maniera molto precisa le variazioni diametrali di un frutto, anche ad intervalli molto brevi, dell ordine dei minuti (Morandi et al., 2007b) (Figura 1). Questo ha permesso di studiare la dinamica giornaliera di accrescimento della pesca in maniera molto approfondita, determinando come variano i flussi in entrata (floema e xilema) ed in uscita (traspirazione) dal frutto nell arco delle 24 ore. I risultati di queste prove hanno mostrato come, in condizioni fisiologiche, la pesca aumenti di volume a partire dal tardo pomeriggio e durante le ore notturne, mentre si restringa al mattino e nel mezzogiorno. Questo andamento risulta abbastanza simile nelle tre fasi di accrescimento che caratterizzano la stagione del pesco, anche se, durante la divisione cellulare, il restringimento diametrale tipico delle ore centrali della giornata è abbastanza limitato e può essere sostituito da un semplice rallentamento o da un temporaneo arresto nella crescita (Morandi et al., 2007a) (Figura 2). Dal momento che la variazione volumetrica di un frutto è data dal bilancio tra la materia fresca importata e quella persa in un certo intervallo di tempo, lo studio approfondito dei flussi vascolari e della traspirazione del frutto ha permesso di comprendere alcuni tra i meccanismi biofisici alla base del suo accrescimento giornaliero. Si è visto come, specialmente nei mesi caldi che caratterizzano fase III, il graduale aumento mattutino nel tasso di traspirazione della chioma richiami grandi quantità di acqua xilematica verso le foglie, in virtù di gradienti di potenziale idrico all interno dell albero sempre più favorevoli al trasporto di acqua verso di esse, che in questo momento della giornata presentano i valori di potenziale più negativi (McFadyen et al., 1996). Allo stesso tempo anche i frutti iniziano a traspirare, ma l abbassamento nel potenziale di pressione xilematica che ne deriva non è sufficiente a competere con le foglie per l acqua ed il flusso xilematico verso il frutto rimane basso nelle ore del mattino (Figura 2b). A causa di questa limitazione idrica mattutina, l acqua persa dai tessuti del frutto per traspirazione è spesso maggiore della materia fresca importata per via floematica e xilematica. Questo determina un bilancio negativo e quindi il restringimento diametrale del frutto tipico delle ore centrali della giornata (Figura 2b). Alcune specie, tra cui il melo (Lang, 1990), mostrano addirittura un retroflusso di acqua xilematica dai 2

3 frutti verso le foglie, a causa dei fortissimi gradienti di potenziale idrico che si vengono a creare tra questi due organi durante le ore più calde della giornata. Prove eseguite su pesche e nettarine, anche in ambienti diversi, non hanno tuttavia mai evidenziato l esistenza di questo fenomeno nel pesco. I carboidrati che si rendono disponibili grazie al processo foto sintetico in corso vengono traslocati per via floematica verso i frutti. Questo trasporto sembra essere favorito proprio dal restringimento del frutto che garantisce il mantenimento di un potenziale idrico sufficientemente basso da creare un gradiente tra i tessuti floematici ed i tessuti sink. Il mantenimento di questo gradiente può permettere che almeno una parte dello scaricamento floematico avvenga per flusso di massa, cioè attraverso un meccanismo passivo (Patrick, 1997). I dati raccolti supportano questa ipotesi e mostrano come durante la fase centrale della giornata, caratterizzata dal restringimento dei tessuti e da bassi potenziali di pressione del frutto, il flusso floematico verso il frutto inizii progressivamente ad aumentare, pur continuando a tassi inferiori anche durante il resto della giornata (Figura 2). Alla luce di quest ipotesi, il restringimento diametrale dei tessuti durante la fase centrale della giornata, assume un ruolo molto positivo nei confronti della qualità finale del prodotto, in quanto permette al frutto di aumentare la sua forza come sink nei confronti degli assimilati disponibili (Morandi et al., 2007a). Nel pomeriggio, gli elevati VPD atmosferici inducono una progressiva chiusura stomatica nelle foglie per proteggerle da eccessive perdite idriche. I tessuti fogliari possono così reidratarsi ed aumentare il loro potenziale idrico, che si porta velocemente a valori molto meno negativi rispetto al mezzogiorno (McFadyen et al., 1996). In questo modo le foglie perdono progressivamente la loro capacità di richiamare acqua verso se stesse e diventano competitori meno forti nei confronti dei frutti. Allo stesso tempo, i frutti continuano a perdere molta acqua dall epidermide, in quanto, a differenza delle foglie, non possono controllare il loro tasso di traspirazione (Gibert et al., 2005). Queste perdite idriche, unite agli assimilati osmoticamente attivi scaricati nelle ore precedenti per via floematica favoriscono il mantenimento di bassi valori di potenziale di pressione nel pomeriggio. In questo modo nello xilema si creano i gradienti di potenziale idrico necessari perché il frutto sia in grado di richiamare acqua verso i suoi tessuti e reidratarsi. Durante il pomeriggio quindi, il flusso xilematico verso il frutto aumenta progressivamente, permettendogli dapprima di recuperare le sue dimensioni iniziali e successivamente di accrescersi in volume (Figura 2) (Morandi et al., 2007a). Questa veloce reidratazione dei tessuti delle ore pomeridiane favorisce un innalzamento del potenziale di pressione che determina un progressivo riequilibrio dei gradienti di potenziale idrico nello xilema. In questo modo i flussi idrici verso i tessuti del frutto diminuiscono gradualmente d intensità durante la notte. Il calo nel tasso di traspirazione tipico delle ore serali e 3

4 notturne fa si tuttavia che il bilancio dei flussi in entrata verso il frutto rimanga positivo e che quindi il frutto continui ad accrescersi anche durante queste ore (Figura 2). Studi effettuati sia su pesche che su nettarine hanno mostrato come la strategia di accrescimento descritta non differisca tra le diverse varietà considerate (Morandi et al., 2007a). In generale, essa si basa su alti tassi di traspirazione dell epidermide che permettono al frutto di abbassare il suo potenziale idrico e quindi di richiamare acqua e sostanza secca da xilema e floema (Patrick, 1997) (Figura 3). Questo determina uno spostamento di ingenti volumi idrici dall albero al frutto e dal frutto all atmosfera che sembrano essere alla base degli alti tassi di crescita tipici di questa specie. Non dimentichiamo che una pesca nelle ultime settimane del suo accrescimento può guadagnare anche 4-5 grammi di sostanza fresca al giorno, quantità non banale se paragonata ai 2 grammi della mela o ai grammi del kiwi, frutti la cui conduttanza di superficie risulta molto bassa nelle fasi finali del loro sviluppo. L EFFETTO DEL MICROCLIMA Il ruolo positivo della traspirazione nell accrescimento della pesca è stato dimostrato da alcune prove che hanno messo a confronto i flussi vascolari di frutti in condizioni di ridotta traspirazione a quelli di frutti controllo. I dati hanno mostrato come l abbassamento nel tasso di traspirazione del frutto determini una graduale riduzione del flusso floematico durante le ore centrali della giornata, che nel giro di qualche giorno si ripercuote sul tasso di crescita giornaliero del frutto stesso (Morandi et al., 2010a) Un risultato di questo tipo suggerisce diverse opportunità per ottimizzare il processo di accrescimento e migliorare la qualità dei frutti alla raccolta. Una gestione colturale capace di modificare il microclima del frutteto in modo da favorire la traspirazione dei frutti potrebbe infatti aumentare la forza dei frutti come sink favorendo la traslocazione dei flussi vascolari verso di essi, ed aumentando la loro capacità competitiva nei confronti dei sink vegetativi. Buone pratiche di potatura verde e/o l applicazione di teli riflettenti, ad esempio, oltre che migliorare la distribuzione della luce all interno della chioma favorendo il processo foto sintetico (Fiori et al., 2003), portano ad un leggero aumento del VPD nel microclima del frutteto. Questo promuove la traslocazione floematica e xilematica verso i frutti che traspirando di più durante le ore centrali della giornata sono in gradi di abbassare maggiormente il loro potenziale idrico (Morandi et al., 2010b). Il confronto tra i flussi vascolari verso frutti su teli di tipo Extenday, in condizioni controllo e sotto rete ombreggiante al 40% (Figura 4) ha messo in evidenza come effettivamente esistano relazioni positive tra il tasso di traspirazione dei frutti e la quantità di materia fresca che 4

5 questi riescono ad importare rispettivamente da floema e xilema. Tali relazioni permangono anche all interno dello stesso trattamento, suggerendo che le variazioni del flusso floematico nelle piante su Extenday o sotto rete ombreggiante non dipendono soltanto da un effetto del trattamento sulla fotosintesi, ma da un effetto sulla forza del frutto come sink, capace di modificare il tasso di crescita dei frutti stessi (Figura 5). Questi trattamenti hanno mostrato un notevole impatto anche sulle caratteristiche qualitative dei frutti alla raccolta (Costa et al., 2003). Nella prova effettuata, l utilizzo di Extenday ha portato alla produzione di frutti con una maggior percentuale di sostanza secca, mentre dalle piante ombreggiate si sono raccolti frutti generalmente più piccoli e meno dolci che, anche se lasciati più a lungo sulla pianta, hanno mostrato minor contenuto in sostanza secca (Tabella 2). Non bisogna però dimenticare che l effetto positivo della traspirazione sull accrescimento della pesca prescinde da una buona disponibilità idrica a livello di albero e da condizioni ambientali che non possono essere portate all estremo. In caso di stress idrico o di VPD troppo elevati infatti, l acqua persa dal frutto per traspirazione potrebbe non essere efficacemente recuperata per via xilematica; allo stesso modo, si potrebbero avere riduzioni nel tasso fotosintetico della chioma con conseguente diminuzione degli assimilati disponibili e ripercussioni negative sul tasso di crescita del frutto stesso. La relazione tra VPD medio giornaliero e tasso di accrescimento del frutto mostrata in figura 6 conferma quanto detto, mostrando come nel caso di studio specifico, le condizioni ottimali di accrescimento del frutto si raggiungano con valori medi di VPD di circa 1.2 kpa. Valori superiori a questa soglia porterebbero invece ad un effetto negativo sul tasso di crescita del frutto. L EFFETTO DEL CARICO PRODUTTIVO Oltre che dall ambiente esterno, il meccanismo di crescita del frutto può risultare fortemente influenzato anche dallo stato fisiologico dell albero, che può variare a seconda del carico produttivo, della presenza o meno di patologie, dello stato idrico. Studi effettuati su piante con diverso carico produttivo hanno messo in luce come questo fattore influenzi fortemente i flussi vascolari e di traspirazione da e verso i frutti e quindi il loro tasso di crescita. E noto come le condizioni di competizione per gli assimilati tipiche di piante non diradate, riducano il tasso di accrescimento dei frutti durante la stagione, determinando lo sviluppo di frutti di volume inferiore. Inoltre, l alta richiesta di assimilati da parte dei sink riproduttivi porta ad uno spostamento nell equilibrio vegeto-produttivo dell albero con la formazione di chiome meno dense e più areate. Tali condizioni modificano fortemente il tasso di traspirazione specifico dei frutti (Morandi et al., 2009). Infatti, frutti più piccoli espongono all atmosfera una superficie maggiore 5

6 per unità di massa di tessuto, risultando quindi più soggetti alle perdite idriche. Questo, unito ad una minor umidità relativa nel microclima della chioma, porta ad un aumento della disidratazione dei tessuti e ad un conseguente abbassamento del loro potenziale di pressione che a partire dal mattino e durante il pomeriggio risulta inferiore a quello di frutti di piante diradate commercialmente o fortemente diradate (Figura 7). L abbassamento nel loro potenziale di pressione rende i frutti di piante non diradate più forti nel richiamare acqua xilematica durante le ore pomeridiane. I risultati ottenuti mostrano infatti come questo flusso sia, a livello specifico, molto maggiore verso i frutti di piante cariche rispetto a quelli di piante controllo e fortemente diradate (Figura 8). Nonostante questo, su base giornaliera, l acqua richiamata per via xilematica non riesce a compensare le forti perdite idriche per traspirazione ed i frutti di piante molto cariche presentano un bilancio xilema traspirazione negativo. D altra parte, le forti condizioni di competizione, diminuiscono la quantità di assimilati disponibili per singolo frutto, e quindi il flusso floematico giornaliero verso i frutti di piante cariche. Questa differenza appare evidente soprattutto durante le ore pomeridiane, quando una maggior quantità di assimilati si rende disponibile, in virtù della fotosintesi avvenuta durante la prima fase della giornata (Figura 8). La diminuzione nella quantità di assimilati disponibili, unita ad un bilancio giornaliero negativo tra flusso xilematico e traspirazione, sono quindi i principali responsabili della ben nota riduzione di crescita tipica dei frutti di piante molto cariche. I dati presentati mostrano però come i frutti di queste piante siano in grado, almeno per un breve periodo durante le ore centrali della giornata, di essere sink più forti nei confronti del flusso floematico (Figura 8). Questa differenza può essere attribuita al loro più basso potenziale di pressione che potrebbe aver generato un gradiente floema-frutto molto favorevole alla traslocazione e/o allo scaricamento degli assimilati verso questi frutti. CONCLUSIONI Dai numerosi studi effettuati risulta evidente come il frutto di pesco abbia evoluto un meccanismo di crescita profondamente diverso rispetto ad altre specie quali il melo, l Actinidia o la vite. Tale meccanismo si basa su ingenti quantità d acqua che passando dal frutto all atmosfera permettono un abbassamento del potenziale idrico del frutto stesso e gli danno la possibilità di richiamare ingenti volumi di materia fresca dal floema e dallo xilema. La comprensione di questo meccanismo, anche a livello sub-giornaliero, crea le basi per una gestione colturale consapevole e orientata verso l ottenimento di un prodotto con caratteristiche ben precise. A questo proposito emergono nuovi ed interessanti spunti per migliorare la qualità dei frutti attraverso una modifica oculata del microclima frutteto. Questa può essere ottenuta orientando la potatura invernale ed estiva verso il buon arieggiamento e la buona illuminazione della chioma, preferendo reti antigrandine chiare, adottando 6

7 teli riflettenti e/o associando questi ultimi alle protezioni antigrandine. Una corretta gestione del microclima deve tuttavia sempre tener conto della situazione idrica del frutteto. BIBLIOGRAFIA Berüter J Sugar accumulation and changes in the activities of related enzymes during development of the apple fruit. Journal of Plant Physiology. 121: Costa G., Corelli Grappadelli L., Noferini M., Fiori G Use of light reflective mulch to affect yield and fruit quality. Acta Horticulturae. 610: Fiori G., Bucchi F., Corelli Grappadelli L., Costa G Effect of reflecting mulch on gas exchange and peach fruit quality [Prunus persica (L.) Batsch]. Proceedings of VI Giornate Scientifiche SOI (Italy). 1: Gibert C., Lescourret F., Génard M., Vercambre G., Pérez Pastor A Modelling the effect of fruit growth on surface conductance to water vapour diffusion. Annals of Botany. 95: Lang, A Xylem, Phloem and Transpiration flows in developing apple fruits. Journal of Experimental Botany 41(227): Lescourret F., Génard M., Habib R., Fishman S Variation in surface conductance to water vapour diffusion in peach fruit and its effects on fruit growth assessed by a simulation model. Tree Physiology. 21: Jones HG, Higgs KH Surface conductance and water balance of developing apple (Malus Pumila Mill.) fruits. Journal of Experimental Botany. 33: McFadyen L.M., Hutton R.J., Barlow, E.W.R Effects of crop load in fruit water relations and crop load in peach. Journal of Horticultural Science. 71(3): Moing A., Carbonne F., Rashad M.H., Gaudillère J.P Carbon fluxes in mature peach leaves. Plant Physiology. 100: Morandi B., Rieger M.W., Corelli Grappadelli L. 2007a. Vascular flows and transpiration affect peach (Prunus persica Batsch.) fruit daily growth. Journal of Experimental Botany 58(14): Morandi B., Manfrini L., Zibordi M., Noferini M., Fiori G., Corelli Grappadelli L. 2007b. A lowcost device for accurate and continuous measurement of fruit growth. Hortscience. 42(6): Morandi B., Corelli Grappadelli L Source and sink limitations in vascular flows in peach fruit. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. ISAFRUIT Special Issue: Morandi B., Manfrini L., Losciale P., Zibordi M., Corelli Grappadelli L. 2010a. The positive effect of skin transpiration in peach fruit growth. Journal of Plant Physiology. In press. 7

8 Morandi B., P Losciale, L. Manfrini, M. Zibordi, L. Corelli Grappadelli. 2010b. Variations in the orchard environmental conditions affect vascular and transpiration flows to/from peach fruit. Acta Horticulturae. In press. Münch E Die Stoffbewegungen in der Pflquanze. Gustav Fischer, Jena. Patrick JW Phloem unloading : Sieve Element Unloading and Post-Sieve Element Transport. Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology 48: Legende Figura 1: Fruttometro, strumento sviluppato dal gruppo di Ecofisiologia del Dipartimento di Colture Arboree dell Università di Bologna, per la misura accurata ed in continuo della variazione diametrale di un frutto. Figura 2: Andamento giornaliero del tasso di crescita relativo (RGR) e dei flussi di traspirazione, floema, xilema da e verso il frutto (cv. Red Gold) durante le fasi I e III. I dati riportati rappresentano la media di almeno 6 frutti e sono stati raccolti ad intervalli di 15 minuti. Figura 3: rappresentazione schematica del meccanismo di accrescimento del frutto di pesco: condizioni microclimatiche favorevoli al mantenimento di un buon tasso di traspirazione dell epidermide, permettono al frutto di abbassare il suo potenziale idrico e quindi di richiamare acqua e sostanza secca da xilema e floema. Figura 4: condizionamento del microclima del frutteto attraverso l adozione di teli riflettenti di tipo Extenday e di reti ombreggianti al 40%. Figura 5: Relazione tra tasso di traspirazione specifico (g g -1 gg -1 ) e flussi di floema (a,b) e xilema (c,d) (g g -1 gg -1 ) da/verso frutti delle cv. Red Gold (a,c) e Alice-col (b,d) su teli riflettenti (Extenday ) (quadrati bianchi), in condizioni controllo (quadrati neri) e sotto teli ombreggianti al 40% (triangoli neri). La prova è stata eseguita durante fase III. Ogni punto rappresenta la media (±ES) di almeno 5 frutti. Figura 6: Relazione tra la media giornaliera nel deficit di pressione di vapore dell atmosfera (VPD) e tasso di crescita giornaliero (AGR) di frutti della cultivar Red Gold in condizioni controllo, durante fase III. Ogni punto rappresenta la media (±ES) di almeno 6 frutti. 8

9 Figura 7: Andamento giornaliero del potenziale di pressione xilematica di frutti su piante non diradate (ND), diradate commercialmente (CTRL) e fortemente diradate (FD). Ogni punto rappresenta la media (±ES) di 4 frutti. Figura 8: Andamento giornaliero del tasso di crescita relativo (RGR) (a) e dei flussi di floema (b) xilema (c) e traspirazione (d) da e verso frutti (cv. Red Gold) di piante non diradate (ND), diradate commercialmente (CTRL) e fortemente diradate (FD), durante fase III. I dati riportati rappresentano la media di almeno 4 frutti e sono stati raccolti ad intervalli di 15 minuti. Le lettere indicano il risultato del confronto statistico tra i trattamenti, effettuato ad intervalli orari mediante analisi ANOVA (P<0.05). 9

10 Tabelle Tabella. 1. Tasso di crescita giornaliero (RGR) e flussi di traspirazione, floema e xilema da e verso frutti delle cvs. Red Gold e Redhaven, durante le fasi I e III. I valori riportati costituiscono la media (±ES) di 6 frutti di circa 4 g in fase I e 100 g in fase III. (g frutto-1 d-1) RGR Traspirazione Floema Xilema FASE I 0.56 ± ± ± ±0.08 (cv. Red Gold) FASE I 0.87 ± ± ± ±0.17 (cv. RedHaven) FASE III 3.6 ± ± ± ±0.47 (cv. Red Gold) FASE III (cv. RedHaven) 3.6 ± ± ± ±

11 Tabella 2: Peso medio (PM), durezza della polpa, contenuto in solidi solubili ( Brix) e percentuale di sostanza secca (%SS) di frutti raccolti a maturazione commerciale ((1 raccolta) su piante sottoposte ai seguenti trattamenti: telo riflettente (Extenday ), condizioni controllo (Ctrl) e rete ombreggiante al 40% (Ombra). Sulle piante ombreggiate è stata effettuata una seconda raccolta a distanza di circa 15 giorni dalla prima per permettere ai frutti di questo trattaento di raggiungere un grado di maturazione omogeneo agli altri trattamenti, in quanto questi frutti presentavano un ritardo di maturazione al momento della 1 raccolta. I valori riportati costituiscono la media (±ES) di 20 frutti. TRT PM (g) Durezza Brix %SS Extenday 166 a 3.43 b a a (1 raccolta) Ctrl 159 a 3.49 b a b (1 raccolta) Ombra 136 b 4.81 a b c (1 raccolta) Ombra 159 a 2.66 c b c (2 raccolta) ** ** ** ** 1 = confronto delle medie tra colonne effettuato mediante test SNK; **: P<

12 FIGURA 1 12

13 FIGURA 2 13

14 FIGURA 3 14

15 FIGURA 4 15

16 FIGURA 5 16

17 FIGURA 6 17

18 FIGURA 7 18

19 FIGURA 8 19