Il microscopio elettronico a scansione

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2 Il microscopio elettronico a scansione Nel SEM (ed in genere nella microscopia elettronica) viene sfruttata l interazione di un fascio di e - con il campione per ricavare informazioni sul campione stesso come nel microscopio luce a riflessione viene utilizzato un fascio di fotoni

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4 I campioni biologici devono subire diversi processi prima di poter essere osservati al SEM. Fissazione Disidratazione Doratura - cioè il ricoprimento del campione con un sottilissimo strato d oro ottenuto tramite vapori Questi trattamenti sono ben sopportati da strutture abbastanza rigide e poco idratate mentre rischiano di rovinare la morfologia di strutture delicate. Per ovviare a questo problema almeno in parte si possono trattare i campioni con sostanze che li induriscano e comunque trattarli con estrema attenzione.

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6 Il SEM è come una buona macro?

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9 Il 3D della microscopia SEM è sufficiente per studiare organismi? I contro della microscopia SEM: Il campione deve subire una processazione lunga e invasiva questo può modificare la struttura e non può essere fatto in vivo Dopo la processazione sarà totalmente opaco agli elettroni e pertanto vedremo solo la superficie esposta ma niente al di sotto. gli oggetti appaiono in 3D ma solo per quello che concerne l esterno E possibile studiare oggetti tridimensionali con la microscopia ottica?

10 Molti campioni biologici sono trasparenti quindi teoricamente è possibile osservare anche campioni spessi studiandone la struttura 3D. Ma essendo trasparenti

11 La fluorescenza La fluorescenza è uno dei due processi radiativi con cui si può verificare il rilassamento di una molecola eccitata, l'altro è la fosforescenza. La luce eccita gli atomi della sostanza fluorescente, facendo saltare gli elettroni in un'orbita più esterna. Subito dopo gli elettroni tornano al livello precedente emettendo luce di lunghezza d onda maggiore.

12 λ A λ B fluorocromo λ A < λ B

13 Ogni fluorocromo è caratterizzato da : SPETTRO DI ASSORBIMENTO SPETTRO DI EMISSIONE Questo significa che un determinato fluorocromo emetterà sempre nel suo spettro di emissione, che non cambia in funzione della luce usata per eccitarlo.

14 Fluorescence filtering Filtro di eccitazione Filtro di emissione

15 Occorre un colorante che mi permetta di visualizzare certe strutture senza rendere opaco il campione La risposta a questa necessità parte dalla fluorescenza Due oggetti trasparenti: quasi non li vedo Pochi micron di spessore Campione biologico Vetrino

16 Occorre un colorante che mi permetta di visualizzare certe strutture senza rendere opaco il campione La risposta a questa necessità parte dalla fluorescenza Uno è colorato: lo vedo Pochi micron di spessore Campione biologico Vetrino

17 Occorre un colorante che mi permetta di visualizzare certe strutture senza rendere opaco il campione La risposta a questa necessità parte dalla fluorescenza Oppure coloro l altro: lo vedo Pochi micron di spessore Campione biologico Vetrino

18 Occorre un colorante che mi permetta di visualizzare certe strutture senza rendere opaco il campione La risposta a questa necessità parte dalla fluorescenza Li coloro entrambi. Li vedo tutti e due male Pochi micron di spessore Campione biologico Vetrino

19 Occorre un colorante che mi permetta di visualizzare certe strutture senza rendere opaco il campione La risposta a questa necessità parte dalla fluorescenza F = fluorocromo che emette verde ma se non è eccitato è trasparente F = Fluorocromo che emette rosso ma se non è eccitato è trasparente Li coloro con sostanze fluorescenti (con diverso spettro di assorbimento ed eccitazione) ma NON pigmentate Pochi micron di spessore Campione biologico F F Vetrino

20 Occorre un colorante che mi permetta di visualizzare certe strutture senza rendere opaco il campione La risposta a questa necessità parte dalla fluorescenza Luce blu Li coloro con sostanze fluorescenti (con diverso spettro di assorbimento ed eccitazione) ma NON pigmentate Pochi micron di spessore Campione biologico F Vetrino

21 Occorre un colorante che mi permetta di visualizzare certe strutture senza rendere opaco il campione La risposta a questa necessità parte dalla fluorescenza Luce verde Li coloro con sostanze fluorescenti (con diverso spettro di assorbimento ed eccitazione) ma NON pigmentate Pochi micron di spessore Campione biologico F Vetrino

22 Ci sono comunque dei problemi: i tessuti biologi possono contenere sostanze fluorescenti gli oggetti non a fuoco danno comunque un po fastidio quindi comunque è meglio per l osservazione che il campione sia sottile.

23 Cioè questo non può funzionare: Luce verde Campione biologico Centinaia micron di spessore Vetrino

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25 La microscopia confocale Confocal Laser Scanning Microscope

26 Occhio dell osservatore Lente oculare Piano in cui si forma l immagine reale Lente obiettivo Campione biologico Vetrino

27 Occhio dell osservatore Lente oculare Lente obiettivo Campione biologico Vetrino

28 Occhio dell osservatore Lente oculare Immagine reale formata dall obiettivo Lente obiettivo Campione biologico Vetrino

29 Occhio dell osservatore Lente oculare Immagine reale formata dall obiettivo Lente obiettivo Campione biologico Vetrino

30 oculare Immagine reale del piano a fuoco obiettivo campione vetrino

31 oculare Immagine reale del piano non a fuoco (sopra) obiettivo campione vetrino

32 oculare Immagine reale del piano non a fuoco (sotto) obiettivo campione vetrino

33 oculare pin hole obiettivo campione vetrino

34 oculare pin hole obiettivo campione vetrino

35 oculare pin hole obiettivo campione vetrino

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40 Ovviamente rendere invisibili i piani non a fuoco migliora la nitidezza delle immagini. Ma permette soprattutto di guardare all interno di campioni TRASPARENTI e MARCATI CON FLUOROCROMI, un piano alla volta Si attua così quello che viene chiamato SEZIONAMENTO OTTICO

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42 SEM

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46 I problemi della microscopia confocale a scansione laser: 1) la luce molto intensa del laser è citotossica (NO 4D) 2) la luce molto intensa del laser causa un veloce decadimento delle sostanze fluorescenti 1) la luce con piccole lunghezze d onda in genere necessarie ad eccitare i fluorocromi non hanno un buon potere di penetrazione nei tessuti

47 MICROSCOPIA CON ECCITAZIONE A DUE FOTONI Ad alcuni di questi problemi ovvia la microscopia a due fotoni (TPE microscopy) Se un fenomeno avviene grazie ad un fotone di lunghezza d onda λ è probabile che avvenga anche grazie a due fotoni di lunghezza 2λ (cioè con metà energia). Lunghezza d onda maggiore = maggiore penetrazione in campioni spessi, meno energia, meno danneggiamento del sistema biologico.

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52 Super resolution microscopy STED STORM etc

53 microtubuli

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55 - Mitocondri -

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58 Green Fluorescent Protein Oltre alla proteina responsabile della chemioluminescenza blu (Aequorina, 470 nm), venne scoperta negli anni 60 una proteina fluorescente con emissione nel verde (508 nm). Aequorea victoria In vivo l aequorina può cedere la sua energia alla GFP invece di emettere luce, e la GFP emette luce verde. La scoperta più importante fu che il gene, messo in un altro organismo, dava origine alla GFP funzionante, dimostrando di avere in se tutte le informazioni per le modifiche posttraduzionali che la proteina subisce e non avere necessità di alcun enzima della medusa

59 La scoperta della GFP valse il premio Nobel per la chimica Tuttavia la storia comincia da lontano quando Shimomura si accorse di una proteina che si accompagnava sempre alla aequorina, nel 1962, e che emetteva luce colorata se sollecitata con altra luce

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61 Mutazioni di un solo aminoacido possono causare cambiamenti negli spettri

62 Douglas Prasher fu il primo (nel 1987) a pensare che la proteina potesse essere usata per taggare altre proteine

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64 Il semplice fatto di poter sapere quando e dove viene sintetizzata una proteina, e poter vedere dove va in vivo, offre enormi potenzialità. Tuttavia possibilità ancora diverse si offrono se le proteine fluorescenti possono essere ingegnerizzate e trasformate in sensori per i più disparati parametri biologici.

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