Il cancro. Copyright (c) by W. H. Freeman and Company

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1 Il cancro

2 I tumori In un animale giovane, l entità della moltiplicazione cellulare è maggiore di quella della morte cellulare e l animale aumenta di dimensioni; In un animale adulto i processi di proliferazione e morte cellulare si bilanciano, determinando una condizione di equilibrio. Alcune cellule dell adulto hanno un rinnovamento molto rapido (es.: cellule intestinali, alcuni globuli bianchi), altre non sono mai sostituite (es. alcune cellule celebrali) Se i raffinati meccanismi che regolano la moltiplicazione cellulare si guastano una cellula inizia a crescere e a dividersi in modo sregolato. Se la predisposizione a dividersi è ereditata dalle cellule figlie si può generare un clone che può dare origine ad una massa cellulare chiamata tumore.

3 Il cancro: una malattia a base genetica Il cancro è causato da mutazioni del DNA. Tra il cancro e le malattie genetiche ci sono 2 differenze fondamentali: a) Il cancro dipende da mutazioni del DNA delle cellule somatiche (salvo mutazioni ereditarie che determinano la predisposizione ad alcune forme di cancro). Le malattie genetiche sono causate da mutazioni del DNA della linea germinale b) Le malattie genetiche possono essere il risultato di mutazioni in singoli geni; il cancro è il risultato di un numero di mutazioni che può variare da 3 a addirittura 20. Per generare tante mutazioni sono necessari anni, e pertanto il cancro è prevalentemente una malattia degli animali anziani.

4 I tumori benigni I tumori benigni compaiono molto frequentemente, soprattutto negli animali anziani, ma spesso costituiscono un piccolo rischio per l ospite essendo localizzati e di piccole dimensioni Le cellule di un tumore benigno hanno caratteristiche citologiche e funzionali simili a quelle delle cellule normali. In genere,, i tumori benigni sono delimitati da una capsula fibrosa e possono essere facilmente asportati chirurgicamente.

5 I tumori maligni I tumori maligni generalmente non rimangono localizzati nel sito di origine, ma invadono i tessuti circostanti, entrano in circolazione attraverso i vasi sanguigni e costituiscono aree di proliferazione distanti dal sito iniziale d insorgenza (metastasi). Le principali caratteristiche che differenziano le cellule tumorali maligne da quelle benigne sono l invasività e la capacità di diffondere. Le cellule maligne, rispetto a quelle normali ed anche a quelle benigne, sono meno differenziate e presentano le caratteristiche di cellule in fase di rapida crescita (elevato rapporto nucleo/citoplasma, numerose mitosi, poche strutture specializzate)

6 Visione macroscopica e microscopica di un tumore che invade il tessuto normale del fegato Metastasi epatica di un tumore polmonare

7 Classificazione dei tumori maligni I tumori maligni sono classificati come: carcinomi, se derivano dall endoderma o dall ectoderma sarcomi, se derivano dal mesoderma. Le leucemie (dal latino sangue bianco ), un tipo di sacomi, si presentano sotto forma di singole cellule in circolo del sangue, mentre la maggior parte degli altri tumori sono masse solide

8 La lamina basale La localizzazione di un tipo cellulare normale in un determinato tessuto od organo viene mantenuto dal riconoscimento tra le cellule e da barriere fisiche, tra cui la più importante è la lamina basale.

9 Alla malignità sono associate alterazioni delle interazioni intercellulari Le cellule metastatiche rompono i contatti con le altre cellule del loro tessuto di origine e superano gli impedimenti costituiti dalla lamina basale e da altre barriere per poter entrare in circolo e colonizzare altre sedi. Spesso le cellule maligne invadono i tessuti circostanti prima di diffondere verso siti distanti attraverso il sistema circolatorio. Le cellule tumorali possono produrre elevati livelli di recettori di superficie per proteine o polisaccaridi della lamina basale (collagene, proteoglicani, glicosamminoglicani) e secernono enzimi che digeriscono la componente proteica di tali molecole. Molte cellule tumorali secernono una proteasi chiamata attivatore del plasminogeno, che converte il plasminogeno, una proteina abbondante del siero, nella proteasi attiva plasmina. La plasmina promuove le metastasi aiutando le cellule tumorali a digerire la lamina basale

10 La metastasi: una dura selezione Meno di una cellula su tra quelle che abbandonano il tumore primario sopravvive e riesce a colonizzare un altro tessuto formando un tumore metastatico secondario. Una cellula per formare una metastasi deve: avere accesso ad un vaso; aderire ad una cellula endoteliale della parete interna di un vaso; migrare nel tessuto sottostante; essere capace di moltiplicarsi in mezzo a cellule di tipo diverso; stabilire adesioni specializzate con le cellule circostanti.

11 I passaggi del processo di metastatizzazione

12 Affinchè i tumori aumentino di dimensioni è necessaria la formazione di nuovi vasi sanguigni Affinchè un tumore diventi di grandi dimensioni (>2mm), è necessaria la formazione di nuovi vasi sanguigni (angiogenesi). Angiogenesi: degradazione lamina basale che circonda un capillare poco distante dal tumore; migrazione delle cellule endoteliali della parete interna del capillare nel tumore divisione di queste cellule endoteliali e formazione di una nuova membrana basale intorno al capillare in formazione. Molte cellule tumorali secernono fattori di crescita che stimolano l angiogenesi (es.: bfgf, TGFα, VEGF=vascular endotelial growth factor) Nell animale adulto, a differenza che nell embrione, non si formano nuovi vasi: un inibitore dell angiogenesi può essere un buon farmaco contro i tumori.

13 Il DNA estratto da cellule tumorali può trasformare cellule normali in coltura Cellule 3T3 normali Cellule 3T3 trasformate con v-src Le cellule che continuano a crescere anche quando le cellule normali sono diventate quiescenti sono dette trasformate. Le cellule trasformate hanno molte caratteristiche tipiche delle cellule dei tumori maligni (modificazioni morfologia, perdita inibizione da contatto, crescita in assenza di adesioni, minore richiesta di fattori Copyright di (c) crescita, by W. H. Freeman secrezione and Company attivatore del plasminogeno)

14 Identificazione e clonaggio molecolare di una specifica sequenza di DNA che causa trasformazione (es.: carcinoma umano della vescica) 1/10 6 cells Questa tecnica ha permesso di isolare una forma mutante del gena ras, ras D

15 La trasformazione neoplastica L espressione della proteina Ras D non è sufficiente a causare la trasformazione di fibroblasti normali di uomo, ratto o topo in coltura primaria. Le cellule 3T3, che possono crescere in coltura indefinitamente, già presentano una mutazione del gene p16, che codifica un inibitore della ciclina chinasi che limita la progressione delle cellule attraverso il ciclo cellulare. Per la trasformazione delle cellule 3T3 sono necessarie sia la perdita di p16, sia l espressione di una proteina Ras costitutivamente attivata (Ras D ). La mutazione del gene ras è stata associata a varie forme di cancro, ma non è stata mai identificata nel DNA di cellule umane normali.

16 Oncogeni e protooncogeni Qualsiasi gene che, come ras D, codifica una proteina capace di trasformare cellule in coltura o di indurre il cancro negli animali in laboratorio viene chiamato oncogene. Il gene di tipo normale (o selvatico) da cui deriva l oncogene viene chiamato proto-oncogene.

17 Affinchè un tumore maligno si sviluppi sono necessarie parecchie mutazioni

18 Dati epidemiologici L incidenza di molti tipi di cancro umano aumenta notevolmente ed in modo esponenziale con l età Gli studi epidemiologici del cancro dell uomo suggeriscono che affinchè una cellula normale si trasformi in una cellula maligna sono necessarie numerose mutazioni

19 Modello di lesioni multiple (multiple( hits) Secondo il modello di lesioni multiple, i tumori maligni si originano mediante un processo di selezione clonale. Una mutazione conferirebbe ad una cellula un leggero vantaggio nel processo di crescita Una seconda mutazione permetterebbe ad una cellula della progenie di moltplicarsi in modo ancora più svincolato portando alla formazione di un tumore benigno. Una terza mutazione cancro Quarta mutazione metastasi Occorrono molti anni per accumulare tante mutazioni e per questo motivo l incidenza dei tumori aumenta con l età

20 Mutazioni somatiche nei tumori dell uomo confermano il modello multi hit Polipi Adenomi benigni Carcinomi Il cancro del colon evolve attraverso stadi morfologicamente distinti che, in genere, sono associati a mutazioni di specifici antioncogeni ed oncogeni. Il primo stadio implica la perdita della funzione del gene APC, un antioncogene. Non tutti i tumori del colon presentano tutte le mutazioni successive e nello stesso ordine Metastasi Il prodotto genico di APC inibisce la capacità della proteina Wnt di attivare l espressione del gene myc, che codifica per un fattore trascrizionale importante per l espressione di geni necessari per la transizione G1 S.

21 Mutazioni ereditarie in geni soppressori tumorali aumentano il rischio di cancro I soggetti con mutazioni ereditarie di un antioncogene (es. APC ) hanno una predisposizione ereditaria per alcuni tipi di cancro. Questi individui ereditano una mutazione di uno degli alleli del gene presente nella linea germinale. La mutazione somatica del secondo allele è necessaria per favorire la formazione di tumori. La sola mutazione ereditaria presente nella linea germinale non è infatti sufficiente a causare lo sviluppo di un cancro. Dal momento che, perchè si avvii il processo di trasformazione neoplastica, è necessaria soltanto la perdita o la mutazione somatica dell altro allele funzionale, e non la comparsa contemporanea di due mutazioni, i tumori in questi individui si sviluppano più precocemente e spesso si ha la formazione di numerosi tumori primari.

22 Un anomalo aumento dell espressione espressione di più oncogeni accellera la cinetica della comparsa di tumori I periodi di latenza che precede la formazione dei tumori è causata dalla necessità di acquisire ulteriori mutazioni somatiche. Topi transgenici che esprimono gli oncogeni myc e/o ras D nelle cellule della ghiandola mammaria

23 I tumori maligni si originano in cellule in fase di crescita Per portare alla formazione di un tumore maligno, le mutazioni oncogeniche devono comparire in cellule in fase di crescita, in modo da poter essere trasmesse alle cellule della progenie. Mutazioni in cellule che non si dividono (neuroni, fibre muscolari) raramente inducono il cancro. I tumori possono insorgere in tessuti composti da cellule differenziate che non si dividono, ma che continuamente vengono sostituite mediante il differenziamente di cellule staminali (es.: eritrociti, epitelio di assorbimento intestino tenue, cellule cheratinizzate della pelle). Poichè le cellule staminali si dividono ininterrottamente durante la vita di un organismo, producendo altre cellule staminali, nel loro DNA possono accumularsi mutazioni oncogeniche che provocano la loro trasformazione in cellule tumorali.

24 La produzione di cellule differenziate (D) da cellule staminali (S)

25 Formazione delle cellule differenziate del sangue dalle cellule staminali ematopoietiche del midollo osseo

26 I proto-oncogeni e gli antioncogeni

27 Proto-oncogeni oncogeni ed oncogeni: : i sette tipi di proteine che contribuiscono al controllo della crescita cellulare Fattori di crescita e proteine virali che attivano i recettori dei fattori di crescita (I e Ia) Recettori per i fattori di crescita (intracellulari ed extracellulari - II) Proteine per la trasduzione del segnale (III) Fattori di trascrizione (IV) Proteine pro- e anti-apoptotiche (V) Proteine per il controllo del ciclo cellulare (VI) Proteine per la riparazione del DNA (VII)

28 Proto-oncogeni oncogeni ed oncogeni: : i sette tipi di proteine che contribuiscono al controllo della crescita cellulare = oncogeni, mutazioni dominanti Fattori di crescita e proteine virali che attivano i recettori dei fattori di crescita (I e Ia) = soppressori dei tumori, mutazioni recessive = aumentano il rischio che possano generarsi mutazioni nelle altre classi di proteine Recettori per i fattori di crescita (intracellulari ed extracellulari - II) Proteine per la trasduzione del segnale (III) Fattori di trascrizione (IV) Proteine pro- e anti-apoptotiche (V) Proteine per il controllo del ciclo cellulare (VI) Proteine per la riparazione del DNA (VII)

29 Le mutazioni che portano ad un incremento della funzione convertono i proto-oncogeni oncogeni in oncogeni La conversione, o l attivazione, di un proto-oncogene in oncogene comporta una mutazione che porta ad un incremento della funzione. Almeno tre meccanismi possono produrre oncogeni dai corrispondenti proto-oncogeni: Le mutazioni puntiformi di un proto-oncogene che portano alla sintesi di una proteina costitutivamente attiva. La duplicazione localizzata (amplificazione genica) di un segmento di DNA che comprende un proto-oncogene, con conseguente anomalo aumento dell espressione della proteina codificata. Una traslocazione cromosomica che porta un gene che regola la crescita cellulare sotto il controllo di un promotore e/o un enhancer diverso, provocando un espressione elevata del gene. Le mutazioni che portano ad un incremento della funzione agiscono come dominanti: la mutazione di uno solo dei due alleli è sufficiente ad indurre il cancro.

30 Gli oncogeni sono stati identificati inizialmente nei retrovirus che causano il cancro Oncogeni nei retrovirus: Il virus del sarcoma di Rous (RSV, 1911), oltre ai geni virali (gag, pol ed env) contiene il gene v-src che è necessario per l induzione del cancro ma non per la funzione virale. Le cellule normali possiedono un gene strettamente correlato al gene v-src (c-src,1977 Bishop e Varmus), che codifica per una tirosina-chinasi. Il gene normale (c-src) è il proto-oncogene, mentre il gene virale (v-src) è un oncogene che codifica per una protein-chinasi mutante constitutivamente attiva. Molti altri oncogeni, derivati da proto-oncogeni cellulari sono stati identificati in diversi retrovirus (es.: Ha-ras nel virus del sarcoma di Harvey)

31 I retrovirus ad azione lenta possono attivare i proto-oncogeni oncogeni cellulari I retrovirus ad azione lenta, che inducono il cancro dopo un periodo di mesi o anni, non possiedono un oncogene. Il virus della leucemia aviaria è un esempio di retrovirus ad azione lenta. Il retrovirus ad azione lenta possono provocare il cancro in seguito all integrazione del loro genoma in prossimità di un proto-oncogene, in modo da provocare un attivazione continua o non appropriata della trascrizione

32 Molti virus a DNA contengono oncogeni La maggior parte delle cellule animali muore in seguito all infezione ad opera di piccoli virus a DNA (es.: SV40), ma in una piccola percentuale di casi il DNA virale viene integrato nel genoma della cellula ospite. Le cellule sopravvivono all infezione ma possono essere trasformate in modo permanente in quanto il DNA virale contiene uno o più oncogeni. A differenza degli oncogeni retrovirali, che derivano da geni cellulari normali e che non hanno alcuna funzione per il virus, gli oncogeni presenti nel genoma dei virus a DNA sono parte integrale del genoma virale e sono necessari per la sua replicazione. Le oncoproteine codificate dal DNA virale integrato ed espresse nelle cellule infettate agiscono stimolando la crescita e la moltiplicazione cellulare.

33 Le mutazioni che portano alla perdita della funzione degli antioncogeni sono oncogeniche Gli antioncogeni codificano proteine che in un modo od in un altro inibiscono la proliferazione cellulare. La perdita di uno o più di questi freni contribuisce all insorgenza del cancro. 5 classi di proteine codificate da antioncogeni: Recettori per ormoni secreti (TGF-β) che inibiscono la moltiplicazione cellulare Proteine intracellulari che regolano od inibiscono la progressione attraverso specifiche fasi del ciclo cellulare (es.: inibitore della ciclina chinasi p16) Proteine responsabili dei check points che arrestano il ciclo se il DNA è danneggiato Proteine che promuovono l apoptosi Enzimi del riparo del DNA Una copia di un antioncogene è sufficiente per controllare la proliferazione cellulare. Gli antioncogeni che presentano mutazioni che portano alla perdita della loro funzione si comportano come caratteri recessivi.

34 Il primo antioncogene è stato identificato in pazienti affetti da retinoblastoma ereditario I bambini affetti da retinoblastoma ereditario ereditano una singola copia difettosa del gene RB ed hanno una elevata predisposizione ai tumori retinici (spesso bilaterali). Perchè si generi il tumore è necessario che anche l altro allele venga inattivato. L allele mutante RB si comporta, a livello cellulare, come carattere recessivo. La predisposizione ereditaria al tumore della mammella è stata associata a BRCA1, un altro antioncogene. Dopo i 50 anni, la probabilità di insorgenza del cancro della mammella è del 60% nelle donne che ereditano un allele BRCA1 mutante, solo del 2% nelle donne normali. Perchè si generi il tumore sono necessarie sia la perdita del secondo allele BRCA1 che un altra mutazione oncogenica.

35 Ruolo delle mutazioni somatiche spontanee del gene Rb nel retinoblastoma, una malattia dell infanzia caratterizzata da tumori della retina. (raro, ad insorgenza tardiva e spesso ad un solo occhio) La proteina Rb fu identificata come il prodotto del gene RB, il prototipo degli Copyright oncosoppressori. (c) by W. H. Freeman and Company

36 Il retinoblastoma ereditario viene ereditato come carattere autosomico dominante

37 La perdita dell eterozigosi eterozigosi (LOH) degli antioncogeni avviene per segregazione errata dei cromosomi (non disgiunzione) o per ricombinazione mitotica + eterozigote

38 La segregazione errata è causata dal fallimento del checkpoint della mitosi

39 Le mutazioni oncogeniche che influenzano la moltiplicazione cellulare. Mutazioni oncogeniche dei geni che influenzano la moltiplicazione cellulare: espressione inappropriata dei geni per i fattori di crescita; espressione di attivatori dei recettori per i fattori di crescita codificati da genomi virali; mutazioni attivanti o un anomalo aumento dell espressione dei recettori per i fattori di crescita; produzione di proteine costitutivamente attive che intervengono nella trasduzione del segnale; perdita di fosfatasi; espressione inappropriata Copyright (c) by dei W. H. fattori Freeman and di Company trascrizione nucleare.

40 Espressione inappropriata dei geni per i fattori di crescita Gli oncogeni raramente derivano da geni che codificano i fattori di crescita; E stato scoperto un solo oncogene - sis - che si è formato spontaneamente a partire da un gene per un fattore di crescita. L oncogene sis, che codifica un tipo di PDGF, può autostimolare in modo anomalo la divisione di cellule che normalmente esprimono recettori per il PDGF mediante induzione autocrina.

41 Gli attivatori dei recettori per i fattori di crescita codificati dai genomi virali, agiscono come oncoproteine Attivazione del recettore dell eritropoietina Il legame del ligando naturale (EPO) provoca la dimerizzazione del recettore ed induce la formazione degli eritrociti a partire dai precursori eritroidi. I precursori infettati dal virus formanti foci splenici esprimono sia la proteina virale gp55, sia il recettore per l EPO. La gp55 attiva il recettore dell EPO, causando una stimolazione non appropriata dei precursori e, alla fine, dopo la comparsa di altre mutazioni, l eritroleucemia.

42 Le mutazioni attivanti i recettori per i fattori di crescita possono provocare la trasformazione cellulare Sintesi di recettori RTK costitutivamente attivi

43 Oncoproteina chimerica risultante da una traslocazione cromosomica L oncogene umano trk è il risultato di una traslocazione cromosomica che porta alla sostituzione del dominio extracellulare del recettore tirosina chinasi Trk con gli amminoacidi ammino-terminali della tropomiosina che tendono a formare un elica superavvolta. Citosolica e costitutivamente attiva

44 Un anomalo aumento dell espressione espressione dei recettori per i fattori di crescita può provocare la trasformazione cellulare Le mutazioni che portano ad un anomalo aumento dell espressione di una proteina recettrice normale possono essere oncogeniche. Es.: Cellule di molti tumori umani alla mammella esprimono quantità elevate del recettore Her2 e vengono pertanto stimolate a moltiplicarsi anche in presenza di concentrazioni molto basse di EGF e degli ormoni correlati. Un anticorpo monoclonale specifico per Her2 è in fase di sperimentazione come trattamento delle forme di cancro alla mammella che overesprimono Her2.

45 Molti oncogeni codificano proteine costitutivamente attive coinvolte nella trasduzione del segnale

46 Mutazioni in geni che codificano componenti della via RTK Ras MAP Mutazione dominante con incremento della funzione del gene ras. Es.: mutazione della glicina 12 con un altro amminoacido che riduce l attività GTPasica. Mutazione recessiva con perdita della funzione del gene NF1 (un antioncogene), che codifica un enzima che attiva la GTPasi (GAP). I pazienti affetti da neurofibromatosi ereditano un allele NF1 mutante. Una successiva mutazione somatica dell altro allele porta alla formazione di tumori benigni delle cellule che formano la guaina che circonda i nervi. Il genoma di alcuni retrovirus murini trasformanti codifica una proteina Raf con attività serina/treonina chinasica costitutivamente attiva

47 Mutazioni in geni che codificano proteine tirosina chinasi che non possiedono funzioni recettoriali: l oncogene bcr-abl Nei pazienti affetti da leucemia mieloide cronica, le cellule leucemiche contengono il cromosoma Philadelphia ed un cromosoma 9 anormale. Questa traslocazione tra i cromosomi 9 e 22 provoca la fusione di un frammento del gene bcr (a funzione ignota, ma il cui segmento N-terminale forma un dominio ad elica superavvolta) con parte del gene c-abl, che codifica una tirosina chinasi. I polipeptidi chimerici bcr-abl formano un tetramero che esibisce in modo costitutivo l attività chinasi di Abl. La proteina Abl non è più localizzata nel nucleo ma nel citoplasma dove si lega ed attiva molte proteine intracellulari per la trasduzione del segnale. La comparsa in una delle cellule che portano la traslocazione di una seconda mutazione porta alla leucemia acuta.

48 Regolazione dell attivit attività della Src e sua attivazione mediante mutazione oncogenica virus del sarcoma di Rous L attività chinasica della proteina Src normale (c-src) viene inattivata dalla fosforilazione della tirosina 527, mentre l idrolisi del fosfato da parte di una fosfatasi la attiva. La tirosina 527 è spesso assente o modificata nelle oncoproteine Src costitutivamente attive.

49 La perdita della fosfatasi PTEN è un evento frequente nei tumori umani Dal momento che molti proto-oncogeni codificano proteine chinasi, da molto tempo si ipotizza che le proteine fosfatasi possano agire come soppressori dei tumori. Recentemente è stato dimostrato che la fosfatasi PTEN funziona da soppressore dei tumori e viene persa nelle fasi avanzate di molti tipi di tumori. La fosfatasi PTEN è insolitamente poco specifica e può rimuovere i gruppi fosfato legati a residui di serina, treonina e tirosina. Si suppone che la sua capacità di defosforilarte il fosfatidil inositolo 3,4,5- trifosfato, prodotto dalla PI-3 chinasi, sia responsabile dei suoi effetti di soppressore dei tumori. Le cellule prive di PTEN hanno elevati livelli di fosfatidil inositolo 3,4,5- trifosfato e di proteina chinasi Copyright B(c) by attiva W. H. Freeman cheand agisce Company prevenendo l apoptosi.

50 L attivazione della protein chinasi B (Akt( Akt) previene l apoptosi Protein chinasi B

51 Gli oncogeni possono codificare fattori di trascrizione Molti oncogeni codificano fattori di trascrizione (es.: Fos, Jun, Myc). I proto-oncogeni c-jun e c-fos codificano proteine che si possono associare per formare un fattore trascrizionale eterodimerico, chiamato AP1, che si lega ad una sequenza presente in molti promotori ed enhancer. Fos e Jun possono agire anche indipendentemente come fattori trascrizionali. c-fos e c-myc stimolano la trascrizione di geni che codificano proteine che promuovono la progressione attraverso la fase G1 ed il passaggio dalla fase G1 a quella S.

52 Attività dei prodotti dei geni c-fos e c-myc in seguito alla stimolazione con siero di cellule 3T3 quiescenti. Per garantire la rapida caduta dei livelli di c-fos e c-myc dopo l induzione della loro sintesi nelle cellule normali, entrambe le proteine ed i corrispondenti mrna sono instabili. Un espressione prolungata può essere oncogenica.

53 L espressione inappropriata dei fattori di trascrizione nucleare può indurre la trasformazione cellulare Nelle cellule tumorali, le forme oncogeniche di c-fos, c-myc o di altri fattori trascrizionali sono spesso espresse a livelli elevati e svincolati da qualsiasi forma di regolazione. Alcune mutazioni che trasformano c-fos in un oncogene consistono in una perdita delle sequenze del gene che rendono l mrna poco stabile. Nel linfoma di Burkitt, il gene c-myc ha subito una traslocazione che lo ha collocato in un sito prossimo ai geni per le catene pesante degli anticorpi, sotto la regolazione dell enhancer dei geni per gli anticorpi. Le duplicazioni localizzate di segmenti di DNA contenenti il gene c-myc sono frequenti nei tumori umani e provocano un espressione elevata di una proteina Myc altrimenti normale.

54 Le mutazioni che causano la perdita del controllo del ciclo cellulare

55 Il passaggio dalla fase G 1 alla fase S è controllato da proto-oncogeni oncogeni e antioncogeni L espressione delle cicline di tipo D (D1, D2 e D3) viene indotta dai fattori di crescita e favorisce l uscita dalla fase G o o la progressione attraverso la fase G 1. Le cicline D si assemblano con le chinasi ciclina-dipendenti Cdk4 e Cdk6 per formare complessi cataliticamente attivi. In assenza dei mitogeni la p27 e la p16 si legano alle proteine chinasi ciclina D-dipendenti, inibendone l attività catalitica. La proteina Rb, nella sua forma defosforilata, si lega a vari fattori di trascrizione, nel loro insieme chiamati E2F, impedendo che possano attivare la trascrizione di molti geni i cui prodotti sono necessari per la sintesi del DNA (es.: DNA polimerasi).

56 Controllo del punto di restrizione

57 I fattori di trascrizione E2F La trascrizione dei geni che codificano molte delle proteine implicate nella sintesi del DNA e dei deossiribonucleotidi viene indotto mentre le cellule procedono attraverso la transizione G1S. La famiglia dei fattori trascrizionali E2F è necessaria per la trascrizione di molti di questi geni e di quelli che codificano la Cdk2 e le cicline A ed E. I fattori E2F, autostimolano la trascrizione dei geni da cui sono codificati. La capacità dei fattori E2F di attivare la trascizione viene inibita se essi sono legate alla proteina Rb e a due proteine ad essa affini, la p170 e la p130. Il legame con la Rb converte i fattori E2F da attivatori in repressori della trascrizione.

58 Il legame con la Rb converte i fattori E2F da attivatori in repressori, dato che la proteina Rb interagisce con i complessi delle istone deacetilasi.

59 La fosforilazione della Rb viene avviata dal complesso Cdk4-ciclina D attivo e viene completata da altre chinasi ciclina-dipendenti dipendenti. La fosforilazione della proteina Rb a metà della fase G 1 provoca la sua dissociazione da E2F, permettendo a quest ultimo di indurre l espressione dei geni che codificano per gli enzimi necessari per la duplicazione del DNA.

60 Il passaggio attraverso il punto di restrizione dipende dall attivazione attivazione dei fattori di trascrizione E2F L attivazione del complesso Cdk2-ciclina E rende indipendente l attivazione di E2F e quindi il passaggio attraverso il ciclo cellulare dall attività dei complessi Cdk4/6-ciclina D. La progressione ha luogo anche se i mitogeni vengono rimossi ed il livello di ciclina D diminuisce. Il punto di restrizione è stato superato! La proteina Rb viene mantenuta fosforilata durante le fasi S, G 2, e M dai complessi Cdk2- e Cdk1- ciclina. La diminuzione del livello dei complessi Cdk-ciclina al termine della mitosi porta alla defosforilazione di Rb da parte delle fosfatasi, la cui attività non è più contrastata, ed all inibizione Copyright (c) by conseguente W. H. Freeman and Company degli E2F.

61 Controllo del punto di restrizione Molte cellule tumorali presentano mutazioni oncogeniche di uno dei geni che codificano proteine che intervengono in questa via di regolazione del ciclo cellulare. Queste mutazioni spingono le cellule a procedere verso la fase S in assenza degli opportuni segnali extracellulari.

62 Mutazioni oncogeniche dei geni coinvolti nel controllo del punto di restrizione Aumento del livello di espressione della ciclina D L amplificazione genica od una traslocazione che pone la ciclina D1 sotto il controllo di una sequenza regolatrice non appropriata (es.: enhancer dei geni per gli anticorpi) porta ad un aumento del livello di espressione di questa ciclina nelle cellule di molti tipi di cancro umano. Perdita della funzione della proteina p16. Le mutazioni, in particolar modo le delezioni, del gene p16, che inattivano la capacità della proteina p16 di inibire l attività delle chinasi ciclina D-dipendenti sono molto frequenti nelle cellule di diversi tumori umani. Perdita della funzione della proteina Rb. La perdita della funzione della proteina Rb, porta all induzione di molti tipi di cancro, in modo particolare del retinoblastoma nei bambini.

63 La perdita della trasmissione del segnale attivata dal TGFβ contribuisce ad indurre una proliferazione cellulare anormale. Il fattore di crescita β derivato dai tumori (tumor derived growth factor β, TGFβ) inibisce la crescita di molti tipi di cellule, compresa la maggior parte delle cellule epiteliali e del sistema immunitario. Il TGFβ induce l espressione del gene che codifica la proteina p15. Questo inibitore della ciclina chinasi prende il posto della p27 nel complesso che questa forma con la Cdk4 e la ciclina D, liberando la p27 per il legame al complesso Cdk2-ciclina E, che così viene inibito. Il complesso Cdk2-ciclina E è necessario per entrare nella fase S e così il TGFβ blocca la cellula in G 1.

64 Il complesso Cdk2-ciclina E è necessario affinchè la cellula possa entrare nella fase S.

65 La perdita della trasmissione del segnale attivata dal TGFβ contribuisce ad indurre la malignità Il TGFβ induce l espressione di geni che codificano proteine della matrice extracellulare, come il collagene e l inibitore di tipo 1 dell attivatore del plasminogeno (PAI-1). L assenza dei TGFβ o di altri componenti della via di trasduzione del segnale può ridurre la sintesi di queste proteine e contribuire all insorgenza delle metastasi (- matrice, + degradazione della matrice)

66 Trasmissione del segnale attivata dal TGFβ (o Smad2) Le cellule di molti tumori presentano mutazioni inattivanti dei geni che codificano i recettori per il TGFβ o le proteine Smad. Queste cellule sono insensibili al controllo inibitorio della crescita mediata dal TGFβ e più facilmente possono formare metastasi.

67 Mutazioni che influenzano la stabilità del genoma

68 L arresto in G 1 e in G 2 delle cellule con DNA danneggiato dipende dall oncosoppressore p53 La proteina p53 è essenziale per il corretto funzionamento del sistema di controllo che blocca nella fase G 1 le cellule umane in cui il DNA è danneggiato. La proteina p53 contribuisce all arresto in G 2 delle cellule umane con DNA danneggiato.

69 Le cellule che possiedono la proteina p53 funzionale vengono bloccate nella fase G 1 quando sono esposte a radiazioni γ, mentre ciò non avviene nelle cellule prive della p53 funzionale Il blocco in G 2 funziona ancora nelle cellule p53 -

70 Il meccanismo del blocco del ciclo cellulare indotto dalla p53 in risposta a danni al DNA Tutti i complessi Cdk1-, Cdk2-, Cdk4- e Cdk6- ciclina La p53 è un fattore trascrizionale altamente instabile, stabilizzato dal DNA danneggiato. I danni prodotti sul DNA portano all attivazione di alcune chinasi, compresa l ATM, ed una proteina chinasi DNA-dipendente. La fosforilazione della p53 da parte di queste chinasi rende la proteina più stabile e provoca quindi un aumento della sua concentrazione La risposta della p53 ad un danno estensivo al DNA porta all induzione dell apoptosi

71 Mutazioni della p53 aboliscono il controllo del checkpoint della fase G 1 L oncosoppressore mutato più frequentemente nei tumori maligni dell uomo (> 50% dei tumori dell uomo) è il p53. Le cellule che possiedono mutazioni nel gene p53 non ritardano l ingresso in fase S in seguito a piccoli danni al DNA nè vanno incontro ad apoptosi in seguito a danni più estesi. Il DNA danneggiato di queste cellule può replicarsi producendo mutazioni e riarrangiamenti che contribuiscono allo sviluppo di una cellula altamente trasformata e metastatica. La radioterapia funziona perchè causa un danno al DNA delle cellule bersaglio che le induce a entrare in apoptosi. Le cellule cancerose in cui si sono verificate mutazioni in entrambi gli alleli p53, sono particolarmente resistenti alla radioterapia perchè non tendono ad attivare il processo apoptotico.

72 Mutazioni della p53 possono comportarsi come dominanti negative. La forma attiva della p53 è un tetramero di 4 subunità identiche. In una cellula una mutazione puntiforme senza senso di uno dei due alleli p53 può abolire quasi completamente l attività della p53, in quanto tutti gli oligomeri conterranno almeno una subunità difettosa e non potranno agire come fattori di trascrizione. Le mutazioni oncogeniche del p53 si possono comportare come dominanti negative, a differenza di quelle degli altri anti-oncogeni come RB che sono attivi nella forma monomerica.

73 La proteina p53 di uomo Le fosforilazioni stabilizza la p53. La proteina MDM2 si lega a p53, inibendo la sua capacità di attivare la trascrizione, e mediando la degradazione della p53 stessa. La fosforilazione di p53 da parte della ATM porta al rilascio della MDM2 legata ed alla stabilizzazione della p53. Il gene che codifica per la MDM2 viene amplificato nelle cellule di molti sarcomi. Proteine codificate da virus tumorali a DNA possono inibire l attività della p53 L attività della p53 viene inibita dal legame di proteine virali, come la E6 del papillomavirus umano, la E1b dell adenovirus. Domini diversi dell antigene T Copyright grande (c) by W. dih. SV40 Freeman and legano Company sia p53 che Rb, inibendo la loro funzione

74 Alcuni agenti cancerogeni per le cellule umane causano mutazioni inattivanti del gene p53 Il fumo di sigaretta èla causa principale del cancro ai polmoni. Il 60% dei tumori umani ai polmoni contengono mutazioni inattivanti del gene p53. L agente chimico benzo(α)pirene, presente nel fumo di sigaretta, subisce un attivazione metabolica nel fegato che lo trasforma in un potente mutageno che causa mutazioni di trasversione GT. Le posizioni 175, 248, 273 del gene p53 sono anche mutate nei tumori umani al polmone Il benzo(α)pirene induce in cellule in coltura mutazioni inattivanti a livello dei codoni 175, 248, 273 del gene p53.

75 Alcuni agenti cancerogeni per le cellule umane causano mutazioni inattivanti del gene p53 L aflatossina, un metabolita fungino presente come sostanza contaminante nei cereali ammuffiti, induce il cancro al fegato. L aflatossina induce una mutazione di trasversione a livello del codone 249 del gene p53, portando alla sua inattivazione. Tutte le mutazioni della p53 aboliscono la sua capacità di legarsi a specifiche sequenze di DNA e di attivare la trascrizione

76 I difetti dei sistemi di riparazione del DNA permettono l accumolo delle mutazioni e sono associati ad alcuni tumori Mutazioni dei geni umani responsabili del meccanismo di escissione riparativa, che ripara il danno prodotto dalle radiazioni UV, aumentano la probabilità di sviluppare alcuni tumori (es. Xeroderma pigmentoso). Le mutazioni di almeno 7 geni diversi possono portare alle lesioni tipiche dello xeroderma pigmentoso (frequenti tumori della pelle in seguito all esposizione alle radiazioni UV provenienti dal sole).

77 I difetti dei sistemi di riparazione del DNA permettono l accumolo delle mutazioni e sono associati ad alcuni tumori Mutazioni dei geni che codificano proteine omologhe a quelle del sistema MutHLS di E. coli, che contribuiscono alla riparazioni degli errori di appaiamento delle basi, aumentano la probabilità di sviluppare alcuni tumori (es.: cancro colon-rettale ereditario con assenza di poliposi). I pazienti affetti da cancro colon-rettale ereditario con assenza di poliposi ereditano una mutazione di un allele del gene che codifica la MutSα, la MutSβ o la MutL L insorgenza di una seconda mutazione che inattiva anche l allele normale porta all insorgenza del tumore. I geni che codificano la MutSα, la MutSβ e la MutL sono antioncogeni.

78 Difetti dei processi cellulari di riparazione del DNA, identificati in alcune malattie dell uomo uomo, sono associati ad una maggiore predisposizione per certi tumori maligni. Nelle cellule con difetti dei processi cellulari di riparazione del DNA, possono facilmente accumularsi mutazioni in molti Copyright altri (c) by W. geni, H. Freeman compresi and Company oncogeni ed antioncogeni.

79 Le anomalie cromosomiche sono comuni nelle cellule dei tumori umani Le anomalie cromosomiche sono molto frequenti nelle cellule tumorali. Le cellule umane possiedono 23 coppie di cromosomi; le cellule tumorali generalmente sono aneuploidi (possiedono un numero anormale di cromosomi, generalmente maggiore) e spesso contengono traslocazioni. Le cellule con un numero anomalo di cromosomi si formano quando non sono funzionali i sistemi di controllo della fase S, che impedisce che una cellula vada in mitosi se il DNA non è stato completamente replicato, o della mitosi, che arresta le cellule in anafase se tutti i cromosomi non sono allineati in modo da segregare correttamente.

80 Traslocazione cromosomica nel linfoma di Burkitt

81 Cellule tumorali possono contenere la duplicazione localizzata di una specifica sequenza di DNA contenente un oncogene (si possono produrre sino a 100 copie di una specifica sequenza) Il DNA duplicato può essere organizzato in tandem a livello di un singolo sito sul cromosoma (Regioni che si colorano in modo omogeneo, HSR) Il DNA duplicato può esistere come piccola struttura a sé stante, simile ad un cromosoma ( doppi minuscoli, double minutes)

82 La metilazione del DNA può inattivare gli antioncogeni. L antioncogene p16 risulta inattivato in molte forme di cancro dell uomo. Spesso il gene è deleto ma in alcuni casi l intera sequenza del gene è normale. In questi casi il promotore del gene p16 viene inattivato a causa di una ipermetilazione in molti tumori umani

83 L espressione della telomerasi può contribuire alla immortalizzazione delle cellule tumorali I telomeri, le estremità fisiche dei cromosomi lineari, sono formati da successioni in tandem di copie multiple di una breve sequenza di DNA, nei vertebrati TTAGGG. I telomeri rappresentano la soluzione al problema dell incapacità della DNA polimerasi di replicare completamente l estremità di una molecola di DNA lineare a filamento doppio. Nella linea germinale e nelle cellule somatiche che si dividono rapidamente (es. cellule staminali), la telomerasi, una trascrittasi inversa a cui è associato uno stampo di RNA, aggiunge ripetizioni TTAGGG alle estremità dei cromosomi. Poichè la maggior parte delle cellule somatiche umane sono prive della telomerasi, i telomeri si accorciano durante ogni ciclo cellulare. La perdita dei telomeri porta alla fusione dei cromosomi ed alla morte cellulare. La maggior parte delle cellule tumorali superano questo ostacolo esprimendo la telomerasi. Alcuni inibitori della telomerasi potrebbero essere utilizzati come agenti terapeutici contro il cancro.