Premio nobel per la medicina 1962 LA STRUTTURA DEL DNA

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1 Premio nobel per la medicina 1962 LA STRUTTURA DEL DNA

2 STRUTTURA DNA (acido deossiribonucleico) BASI AZOTATE adenina (A) citosina (C) guanina (G) timina (T). Adenina e guanina sono composti eterociclici chiamati purine, mentre citosina e timina sono anelli pirimidinici. Doppia elica antiparallela Una sequenza di DNA è definita senso se la sua sequenza è la stessa del relativo mrna. La sequenza posta sul filamento opposto è invece detta antisenso. Dal momento che le RNA polimerasi lavorano producendo una copia complementare, il filamento necessario per la trascrizione è l'antisenso. gruppo fosfato deossiribosio (zucchero pentoso) base azotata Si forma un legame covalente tra il gruppo fosfato di un nucleotide e lo zucchero del nucleotide precedente

3 I NUCLEOTIDI BASE AZOTATA Gruppo fosfato Il DNA è un polimero I suoi monomeri sono i NUCLEOTIDI I nucleotidi sono formati zucchero Gruppo fosfato zucchero deossiribosio base azotata

4 Le basi azotate PURINE PIRIMIDINE

5 La complementarietà una purina si appaia con una pirimidina L adenina si appaia con la timina (2 legami H) La guanina si appaia con la citosina (3 legami H)

6 Le 2 catene di nucleotidi si avvolgono l una sull altra a spirale per questo la molecola di DNA viene chiamata la DOPPIA ELICA la molecola può venire duplicata facilmente il DNA viene utilizzato dai viventi come un codice per registrare e trasmettere informazioni

7 Funzioni del DNA Materiale ereditario: viene duplicato e trasmesso alle cellule figlie Programma della cellula: contiene le informazioni per la sintesi di tutte le proteine dell organismo Ogni tratto di DNA che porta l informazione per la sintesi di una proteina GENE Nel DNA delle cellule della specie umana ci sono circa geni, in quello di un batterio, poche migliaia

8 REPLICAZIONE SEMICONSERVATIVA È il processo attraverso il quale da una molecola madre si formano due molecole figlie ciascuna formata da un elica vecchia e un elica nuova. La duplicazione del Dna avviene nella fase S (sintesi) del ciclo cellulare. L enzima che permette questo processo si chiama DNA polimerasi. Una volta che è avvenuta la duplicazione del DNA la cellula deve dividersi. Nei batteri il DNA si duplica a partire da una forcella di replicazione in modo bidirezionale fino a quando tutta la molecola si è duplicata

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10 Meselson e Stahl fecero crescere dei batteri in un terreno di coltura ricco dell'isotopo pesante 15 N. Questi microorganismi metabolizzarono l' 15 N che quindi venne ad essere introdotto in molte molecole biologiche; tra queste molecole bisogna ricordare le basi azotate del DNA. In questo modo il DNA presente nei batteri era un "DNA pesante", poiché inglobava atomi di azoto più pesanti della norma. Alcuni batteri furono poi prelevati, lisati e, con opportune tecniche di laboratorio, venne estratto il loro DNA. Quest'ultimo venne aggiunto ad una provetta contenente una soluzione concentrata di Cloruro di Cesio (CsCl 6M). La provetta fu poi centrifugata. In queste condizioni nella provetta si forma un gradiente di densità dal momento che il CsCl tende a concentrarsi verso il fondo della stessa. Una volta che si è formato il gradiente di densità, il DNA migra per fermarsi nella regione della soluzione che ha densità uguale alla sua. Il DNA può essere messo in evidenza in seguito all'introduzione di particolari sostanze che si legano ad esso e divengono visibili se illuminate da luce ultravioletta. Ciò che si vide sperimentalmente fu una banda verso il fondo della provetta. A questo punto alcuni batteri furono trasferiti dal primo terreno di coltura in un nuovo terreno "standard", in cui cioè era presente 14N anziché 15N. I microorganismi metabolizzarono l'azoto includendolo nelle basi azotate dei nucleotidi che andranno a formare (tra le altre cose) le nuove eliche di DNA. Alcuni batteri furono prelevati dal terreno "standard", furono lisati e venne estratto il DNA. In seguito ad una centrifugazione in gradiente di densità si ottenne un'unica banda posta in posizione superiore rispetto a quella del caso precedente: il DNA era quindi più leggero. Trascorso il tempo necessario per la successiva replicazione del DNA venne ripetuta la suddetta procedura. In questo caso si ottennero due bande: la prima in posizione nettamente superiore a quelle ottenute nei casi precedenti, la seconda nella stessa posizione di quella dell'esperimento precedente. A questo punto possiamo identificare: un DNA "pesante". In cui per forza erano presenti due filamenti 15N. un DNA "medio". In cui per forza era presente un filamento 15N e un filamento 14N. un DNA "leggero". In cui per forza erano presenti due filamenti 14N.

11 .l'unico modello in grado di spiegare i "pesi" delle varie molecole di DNA era quello della replicazione semiconservativa

12 Ingredienti della replicazione del DNA

13 REPLICAZIONE DNA PROCARIOTICO 1 ORIGINE DI REPLICAZIONE PROCESSO BIDIREZIONALE CI SONO 2 FORCELLE DI REPLICAZIONE CHE SI MUOVONO IN VERSI OPPOSTI E CHE AL TERMINE DEL PROCESSO SI INCONTRANO L'origine di replicazione di Escherichia coli, nota come oric, consiste di ripetizioni di una sequenza di nucleotidi. La DnaA è una proteina deputata al riconoscimento e al legame di tali ripetizioni.determina la denaturazione della regione ricca in A/T e crea quindi regioni a singolo filamento La DNA ELICASI separa i filamenti dall origine in direzione 5-3 Ci sono proteine che impediscono che le eliche si richiudano. La DNA POLMERASI e l enzima che catalizza la polimerizzazione dei desossiribonucleotidi. catalizza il legame covalente tra il gruppo fosfato di un nucleotide e lo zucchero del nucleotide precedente

14 DNA polimerasi I meccanismo di riparazione DNA polimerasi II meccanismo di riparazione DNA polimerasi III sintesi dei filamenti di DNA. Estende la catena aggiungendo un nucleotide per volta all estremo 3 -OH Le DNA polimerasi batteriche hanno un attività esonucleolitica 3-5 (direzione opposta a quella di sintesi)

15 La sintesi del DNA inizia in un punto in cui la molecola viene preventivamente srotolata chiamato origine. Si forma così un'ansa di replicazione alla cui estremità troviamo le "forcelle di replicazione" e la sintesi può proseguire in due direzioni. Nel DNA batterico circolare, le forcelle si incontrano in un punto della circonferenza opposto all'origine.

16 Poiché le eliche sono antiparallele, ne consegue che un'elica, chiamata catena leader, o stampo, viene letta e copiata nella direzione di avanzamento della forcella e procede in modo continuo e veloce (un unico innesco a RNA). L'altra elica dovrà essere sintetizzata con ritardo e in modo discontinuo dovendo attendere lo srotolamento dell'elica veloce. Okazaki, biologo giapponese, scoprì che la catena discontinua viene sintetizzata, con frammenti, in direzione opposta all'avanzamento della forcella. E' da tenere presente che ogni frammento di Okazaki termina con un'estremità 3'OH libera Ha una struttura asimmetrica: leading strand sintetizzato con continuità Lagging strand sintetizzato con discontinuità

17 Le DNA polimerasi non possono sintetizzare catene di DNA senza un primer, un piccolo segmento di acido nucleico con un gruppo ossidrilico libero in posizione 3 -OH. Le DNA polimerasi sono capaci di leggere nucleotidi solo nella direzione 5-3 Durante la replicazione del materiale genetico, il primer è costituito da RNA. Una RNA polimerasi DNA-dipendente, detta primasi, sintetizza un piccolo tratto di RNA complementare allo stampo molecolare, utilizzato come primer dalla DNA polimerasi. Una volta iniziata la sintesi di DNA, il primer di RNA viene digerito da enzimi con attività 5 3 esonucleasica. La reazione di polimerizzazione richiede i quattro precursori attivati, datp, dgtp, dctp e dttp ed avviene direttamente sulla catena di DNA stampo. Nel filamento guida la DNA polimerasi può attaccare i nucleotidi in direzione 5-3 a partire dall innesco Nel filamento lento la sintesi procede sempre in direzione 5-3 ma in direzione opposta a quella della forcella di replicazione

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20 LE PROTEINE INIZIATRICI SI LEGANO CON INTERAZIONI SEQUENZE SPECIFICHE ALLE ORIGINI DI REPLICAZIONI RICCHE IN A-T

21 Il legame dei dntp allo stampo avviene mediante i legami idrogeno, ma anche la forma delle basi e controlli sterici nel sito attivo della DNA-polimerasi, concorrono al corretto appaiamento delle basi La frequenza di errore viene ridotta anche grazie ad accurati meccanismi enzimatici. Tutte le DNA polimerasi possiedono un attività esonucleasica 3 5 che consente di rimuovere un nucleotide appena inserito Tale attività di proof reading (lettura delle bozze) è altamente specifica per gli appaiamenti sbagliati e aggiunge un ulteriore fattore di accuratezza che riduce la frequenza di errore totale. La DNA polimerasi è in grado di rimuovere gli inneschi a RNA e di riempire i gap con il DNA. I frammenti vengono poi uniti dalla DNA ligasi Dalla parte opposta rispetto a Ori C il cromososma di E. Coli contiene un paio di sequenze di terminazione TER Una proteina si lega a queste sequenze e vengono bloccate le forcelle di replicazione La DNA ligasi lega tutti e quattro i filamenti di DNA creando due molecole circolari a doppio filamento concatenate. Le topoisomerasi sono enzimi che provocano delle rotture temporanee nei filamenti di DNA e poi li riuniscono dopo la formazione di due molecole circolari distinte

22 L'elicasi è un enzima che agisce rompendo i legami idrogeno instaurati tra le basi complementari. Inoltre questo enzima agisce in coppia con la DNA-girasi che separa i 2 filamenti di DNA. Le topoisomerasi determinano un aumento o una diminuzione del grado di superavvolgimento. Possono operare tagli a singolo o doppio filamento. Tali enzimi svolgono un ruolo fondamentale nell'impacchettamento e nella replicazione del DNA. Primasi:All'inizio della replicazione del DNA, le primasi legano le elicasi a formare un complesso chiamato primosoma. Attivate proprio dalle elicasi, le primasi sintetizzano una breve molecola di RNA (detta appunto primer), complementare alla molecola di DNA adiacente. Il primer viene utilizzato poi come punto di partenza per le DNA polimerasi. Ligasi: lega due frammenti di DNA che hanno subito una rottura a doppio filamento (ad esempio nei processi di riparazione del DNA). Può anche legare una rottura a singolo filamento, come ad esempio accade durante il processo di replicazione del DNA, nel quale la DNA ligasi agisce sul filamento che ha la direzione 3'->5', sintetizzato a frammenti. Questo enzima catalizza infatti la formazione di legami covalenti fosfodiesterici tra nucleotidi di DNA adiacenti (lega l'estremità 3' del nuovo tratto di DNA con l'estremità 5' del tratto precedentemente sintetizzato). ATP + (deossiribonucleotide)n + (deossiribonucleotide)m = AMP + difosfato + (deossiribonucleotide)n+m

23 Il processo di replicazione del DNA nei procarioti e negli eucarioti è molto simile, ma nelle cellule eucariote la quantità di DNA è maggiore ed è organizzato in strutture lineari Esistono 2 tipi di cromatina: 1)EUCROMATINA (+dispersa e si colora debolmente) e 2)ETEROCROMATINA (+ condensata si colora + intensamente).

24 I Genomi degli Eucarioti: Eucromatina ed Eterocromatina Eucromatina: regioni cromosomiche non condensate, attivamente trascritte e ad alta densità genica (fibre 30 nm). Eterocromatina: (facoltativa o costitutiva): cromatina mediamente o altamente condensata e generalmente non trascritta, ad alta percentuale di sequenze ripetute e contenuto di geni relativamente basso. Comprende regioni telomeriche e centromeriche. In una tipica cellula di mammifero il contenuto di eterocromatina è pari a circa il 10%. in Drosophila melanogaster costituisce il 34% del genoma totale. 24

25 I Genomi degli Eucarioti: contenuto in DNA Si osserva che il contenuto totale di DNA negli eucarioti e quindi la dimensione del genoma è correlata alla complessità dell organismo (ad es., il genoma umano è più grande di quello degli insetti che è a sua volta più grande di quello funghi). Esistono però diverse eccezioni: es. il genoma di X. laevis è grande quanto quello dei mammiferi; altri anfibi hanno un genoma circa 50 volte più grande del genoma umano; tra le piante, il genoma di Zea Mais èpiù grande di quello umano. In genere, per un dato raggruppamento tassonomico, la dimensione del genoma è approssimativamente proporzionale alla complessità dell organismo 25

26 Paradosso del valore C La mancanza di correlazione tra la complessità genetica/morfologica di un organismo e le dimensioni del suo genoma è definita Paradosso del valore C. Il Paradosso del valore C è spiegato considerando: le dimensioni dei geni discontinui (numero - grandezza introni) La quantità di DNA ripetitivo, che rappresenta il componente più abbondante della porzione di DNA non codificante dei genomi eucariotici

27 REPLICAZIONE DNA EUCARIOTICO PIU ORIGIN DI REPLICAZIONE ARS (sequenza replicante autonoma ricca in A-T)) Ogni origine di replicazione prende il nome di replicone, da cui il processo si avvia in maniera bidirezionale Riduzione del tempo di replicazione LE FORCELLE REPLICATIVE ENTRANO IN CONTATTO TRA LORO 5 DNA POLIMERASI: αβδε: agiscono nel nucleo γ: agisce nei mitocondri α,δ: replicazione DNA cromosomico β, ε: riparazione danni al DNA Sintesi di istoni che formano ottameri e si associano al DNA nella forcella replicativa

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29 Il telomero è la regione terminale del cromosoma, composta di DNA altamente ripetuto, che non codifica per alcun prodotto proteico. Ha un ruolo determinante nell'evitare la perdita di informazioni durante la duplicazione dei cromosomi. Le sequenze telomeriche variano da organismo in organismo. Il DNA telomerico è sintetizzato dalle telomerasi, DNA polimerasi RNA-dipendenti altamente specializzate che introducono centinaia di ripetizioni nucleotidiche alle estremità dei cromosomi. E una classe di retrotrascrittasi specializzate, presenti in numerosi organismi (tra cui l'uomo), ma non in tutti (e soprattutto non in tutte le fasi dello sviluppo). Utilizza frammenti di RNA come stampo per l'elongazione dei telomeri. E capace di allungare l'estremità 3'-OH del filamento stampo della catena tardiva. Contiene un sito catalitico che polimerizza i desossiribonucleotidi complementari ad un RNA stampo, che essa stessa contiene. In particolare, nell'uomo le telomerasi sono attive solo nelle cellule della linea germinale: ciò significa che, ad ogni replicazione, i telomeri umani si accorciano di un certo numero di paia di basi. La DNA polimerasi non è in grado di replicare il cromosoma fino alla sua terminazione; se non ci fossero i telomeri, che quindi vengono accorciati ad ogni replicazione, la replicazione del DNA comporterebbe in ogni occasione una significativa perdita di informazione genetica. I telomeri si accorciano a causa del meccanismo di replicazione del filamento lagging del DNA. l ultimo primer di RNA viene tagliato ma non sostituito con il DNA Questo genera un continuo processo di accorciamento di queste regioni

30 SEQUENZA DI RNA COMPLEMENTARE ALLE SEQUENZE RIPETUTE NEI TELOMERI

31 LA TELOMERASI SI LEGA ALL ESTREMITA 3 A SINGOLO FILAMENTO DEL CROMOSOMA

32 L ALLUNGAMENTO DEL 3 DEL TELOMERO CREA LO SPAZIO PER LA FORMAZIONE DI UN NUOVO FRAMMENTO DI OKAZAKI

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34 Esistono teorie che associano il continuo accorciarsi dei telomeri con la senescenza delle cellule della linea somatica e con la prevenzione del cancro. Questo perché i telomeri agirebbero come una sorta di orologio biologico, legato cioè ad un numero massimo di mitosi (e di replicazioni del DNA), al termine del quale la cellula sarebbe troppo vecchia per essere mantenuta in vita e prenderebbe la via dell apoptosi. La telomerasi è espressa dalle cellule embrionali ma non dalle cellule somatiche dell organismo Adulto Le uniche eccezioni sono costituite dalle cellule germinali e da quelle attivamente proliferanti (cellule staminali, strati basali epiteliali il mantenimento della lunghezza dei telomeri è un segno distintivo di molti tipi di cancro nei mammiferi. Nell'uomo, ad esempio, numerosi tumori sono in grado di aumentare l'attività della telomerasi, ottenendo una capacità di replicazione pressoché infinita. Altri tipi di carcinoma, invece, sono in grado di avviare pathway alternativi di allungamento dei telomeri

35 Tutte le cellule possono dividersi un numero definito di volte: CPD (Divisioni Cellulari Permesse)

36 Una volta raggiunto il CPD la cellula entra nella senescenza replicativa, cioè l incapacità di proliferare ulteriormente Interviene il processo di APOPTOSI, che porta alla morte della cellula

37 La lunghezza dei telomeri determina il numero di divisioni cellulari permesse. Il CPD dipende dal tipo di cellula e dal tessuto di cui essa fa parte. Quando i telomeri raggiungono una lunghezza critica la cellula entra nella senescenza replicativa perchè viene emesso un segnale che impedisce alla cellula di dividersi ancora. Se vengono a mancare i sistemi di controllo della p53 o della p16/rb, la cellula supera la fase di senescenza e può riattivare la telomerasi diventando immortale

38 Nelle cellule cancerose: L attività della telomerasi si incrementa dell 80-90% I telomeri sono più corti del normale

39 Per mutazione genetica si intende ogni modificazione stabile ed ereditabile nella sequenza nucleotidica di un genoma o più generalmente di materiale genetico (sia DNA che RNA) dovuta o al caso, ma non alla ricombinazione genetica. Una mutazione modifica quindi il genotipo di un individuo e può eventualmente modificarne il fenotipo a seconda delle sue caratteristiche e delle interazioni con l'ambiente.

40 Le mutazioni spontanee sono mutazioni provocate da fattori chimici endogeni e da errori nei processi che si attuano sul materiale genetico; la definizione di mutazione spontanea è di mutazione che avviene in assenza di agenti mutageni noti. Non sono molto frequenti, ma sono comunque inevitabili vista la intrinseca imperfezione di ogni meccanismo molecolare. Gli errori possono essere dovuti a: Reazioni che trasformano una base azotata in una diversa Errori nei processi di replicazione, della ricombinazione e della riparazione del DNA. Ad esempio può essere dovuta alla DNA polimerasi che aggiunge nucleotidi non corretti; ciò può generare una trasversione se c'è lo scambio di una purina con una pirimidina o viceversa; una transizione se c'è lo scambio di una purina con un'altra purina oppure di una pirimidina con un'altra pirimidina. Danni ossidativi Dovuti alla formazione spontanea nella cellula di specie con atomi di ossigeno molto reattive, in grado di attaccare il DNA e causare danni al singolo o al doppio filamento e danneggiamento delle basi azotate. Le mutazioni indotte sono invece prodotte dall'azione di particolari agenti fisici o chimici detti appunto agenti mutageni. È detto mutagenesi il processo che determina una mutazione indotta e mutagenizzato l'organismo in cui è stata prodotta. Si distinguono i danni per mutazioni indotte in: Sostituzione delle basi con molecole con struttura analoga a quelle comunemente presenti nel DNA ma che formano appaiamenti diversi e quindi errati. Aggiunta di gruppi sostituenti alle basi azotate: anche in questo caso generando molecole con capacità di appaiamento non corrette. Danneggiamento delle basi azotate Inserzione o delezioni di basi. I mutageni fisici sono soprattutto radiazioni ionizzanti (raggi X, raggi gamma) e non ionizzanti (raggi UV); Gli agenti chimici sono molto numerosi e appartengono a diverse classi di composti. Oltre che per la natura i mutageni differiscono anche per spettro mutazionale, ovvero per il tipo (o i tipi) di mutazione che possono provocare. Una importante differenza tra mutageni fisici e chimici è che i primi agiscono indipendentemente dall'organismo; i mutageni chimici invece possono avere effetti diversi in funzione del sistema biologico. Mentre una radiazione, infatti, colpisce direttamente il materiale genetico, un composto chimico può interagire con altre molecole (enzimi, metaboliti, specie reattive...) presenti nella cellula che ne possono variare le caratteristiche.

41 MUTAZIONI (classificazione in base ai meccanismi di generazione): Inserzioni Delezioni Sostituzione di basi

42 inserzioni di basi: Riguardano uno o pochi nucleotidi Conseguenze gravi se nel DNA codificante Espansioni di triplette ripetute (CGG)

43 Delezioni di basi Riguardano uno o pochi nucleotidi Conseguenze gravi se nel DNA codificante Piu comuni a livello di sequenze ripetute in tandem (VNTR) per crossing-over ineguale

44 Sostituzioni di basi: Transizioni = Sostituzioni di purina (A o G) con un altra purina (G o A) o di una pirimidina (T o C) con un altra pirimidina (C o T) Transversioni = Sostituzioni di purina (A o G) con una pirimidina (T o C) o viceversa

45 MUTAZIONI (classificazione in base alle conseguenze funzionali) Sostituzione che riguarda regioni potenzialmente rilevanti (esoni, regioni regolatrici espressione, siti di splicing e poliadenilazione, regioni conservate in specie diverse) Sostituzione che riguarda sequenze senza un significato funzionale

46 MUTAZIONI (classificazione in base alle conseguenze funzionali) Sostituzioni in regioni potenzialmente rilevanti da un punto di vista funzionale Sostituzione sinonima o silente: non determina un cambio di aminoacido Sostituzione non sinonima: determina un codone specificante un aminoacido differente rispetto a quello originario. Puo essere: Conservativa (aminoacido simile da un punto di vista biochimico) Non conservativa (aminoacido diverso da un punto di vista biochimico) Mutazione non senso: sostituzione di un codone che specifica un aminoacido con un codone di fine sintesi

47 CODICE GENETICO UUUPhe UCUSer U A U Tyr U G U Cys UUCPhe UCCSer U A C Tyr U G C Cys U U A Leu U C A Ser U A A STOP U G A STOP U U G Leu U C G Ser U A G STOP U G G Trp C U U Leu C C U Pro C A U His C G U Arg C U C Leu C C C Pro C A C His C G C Arg C U A Leu C C A Pro C A A Gln C G A Arg C U G Leu C C G Pro C A G Gln C G G Arg A U U Ile A C U Thr A A U Asn A G U Ser A U C Ile A C C Thr A A C Asn A G C Ser A U A Ile A C A Thr A A A Lys A G A Arg A U G Met A C G Thr A A G Lys A G G Arg G U U Val G C U Ala G A U Asp GGUGly G U C Val G C C Ala G A C Asp GGCGly G U A Val G C A Ala G A A Glu GGAGly G U G Val G C G Ala G A G Glu G G G Gly

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49 MUTAZIONI FRAMESHIFT Le mutazioni frameshift (dall'inglese, spostamento dell'ordine di lettura) sono dette anche mutazioni da scivolamento. Sono causate dall'aggiunta (inserzione) o l'eliminazione (delezione) di uno o pochi nucleotidi. Nel caso di inserzione o delezione di nucleotidi in numero non multiplo di tre, viene alterato l'ordine di lettura di tutti i codoni successivi nell'ordine a quello inserito o deleto. Scoperte da Crick e Brenner studiando il codice genetico, si tratta di mutazioni quasi sempre dannose.

50 Gli effetti possono essere notevolmente diversi a seconda del tipo di mutazione e della posizione in cui questa si verifica. Una mutazione può non portare a nessuna conseguenza e questo quando interessa DNA che non codifica (o meglio sembra non codificare) per nessun prodotto genico Se la mutazione va invece ad alterare le sequenze codificanti, ovvero i geni, si ha una variazione nel tipo o nella quantità del corrispettivo prodotto genico, che può essere una proteina o RNA funzionale (rrna, trna, snrna ecc.). Parliamo in questo caso di mutazione biochimica. se la mutazione biochimica porta a una variazione visibile del fenotipo si parla di mutazione morfologica. Inoltre distinguiamo, sempre in relazione agli effetti, in: mutazione positiva: porta un vantaggio evolutivo mutazione neutra: non risulta in un depotenziamento della capacità riproduttiva dell individuo; mutazione semiletale: rende più difficoltosa la perpetuazione riproduttiva dell individuo (il tipico esempio sono le malattie genetiche che debilitano in qualche modo l individuo, rendendolo meno capace di riprodursi, senza però impedirglielo totalmente) mutazione subletale: non permette all individuo di raggiungere l età riproduttiva; mutazione letale: porta alla morte dell'individuo in fase embrionale o fetale.

51 SISTEMI DI RIPARAZIONE FOTODIMERIZZAZONE Il dimero di timina si forma tra due residui di timina posti sullo stesso lato della doppia elica del DNA, per azione della luce ultravioletta. Il dimero causa una distorsione nella doppia elica del DNA che ne impedisce la replicazione e l espressione. Questo danno viene riparato a opera di diversi enzimi (nell E. coli si tratta di tre attività enzimatiche) che riconoscono la distorsione, tagliano la porzione danneggiata e ricostruiscono le parti mancanti. Il dimero di timina può anche essere tagliato fotochimicamente, in quanto quasi tutte le cellule contengono un enzima fotoattivatore che si lega al dimero di timina e, assorbendo un fotone (fotoriattivazione), taglia il dimero nelle sue basi originali, favorendo il ritorno alla condizione iniziale. FOTOLIASI La fotoliasi ha alta affinità per queste strutture chimiche, alle quali si lega reversibilmente e le ripara. Questo enzima funziona come un meccanismo di riparazione del DNA quando la luce di lunghezza d'onda compresa fra 320 e 370 nm lo colpisce attivandolo. La reazione enzimatica prevede la rottura del dimero e la ricostituzione della struttura corretta delle basi (fotoriattivazione).

52 Deaminazione della citosina La deaminazione ossidativa spontanea della citosina determina la formazione di uracile, con rilascio di ione ammonio. Verrà quindi inserito un uracile al posto della corretta citosina; l'appaiamento errato può essere riconosciuto e riparato da particolari sistemi di riparazione del DNA: in particolare specifiche glicosidasi riconoscono questo nucleotide che non è comune nel DNA e lo sostituiscono con la citosina. Deaminazione della 5-metilcitosina La deaminazione di questa base provoca la formazione di timina, un nucleotide normalmente presente nel DNA. Alcune gilcolidasi sono in grado di riconoscere gli appaiamenti errarti che derivano da questa deaminazione (T-G) e sostituire alla timina la citosina. La 5-metilcitosina è presente soprattutto nei procarioti, formata in seguito a metilazione di una citosina tramite una metil transferasi. La formazione di questa base modificata è correlata a processi di silenziamento genico. Spesso la 5-metilcitosina è presenti nei siti CpG:

53 Meccanismi per escissione di basi (BER): Ripara il danno che coinvolge un solo nucleotide DNA glicosilasi riconosce e rimuove la base alterata L endonucleasi rimuove lo zucchero e il gruppo fosforico Una DNA POLIMERASI riempie il buco Una DNA ligasi unisce i filamenti Meccanismi per escissione di nucleotidi (NER): Ripara il danno di frammenti da 2 a 20 nucleotidi Utilizza differenti enzimi (nulceasi, elicasi, DNA polimerasi, DNA ligasi) rispetto al BER e rimuove più basi Mismatch Repair (MMR) corregge errori di replicazione e di ricombinazione genetica che determinano la formazione di nucleotidi male appaiati in seguito alla replicazione del DNA.

54 Meccanismi di risposta cellulare al danno del DNA La cellula reagisce ad un danno del DNA mettendo in opera una serie di strategie per confinare e limitare il danno. In particolare si ha l arresto del ciclo cellulare fino alla riparazione del danno. Questo meccanismo avviene grazie ad una serie di proteine La prima è chiamata ATM, un sensore intracellulare in grado di avvertire il danno del DNA. ATM, rilascia un segnale ad una seconda proteina P53 che viene fosforilata e stabilizzata. P53 è un fattore trascrizionale che è stato denominato il guardiano del genoma. P53 quando è attivata da ATM attiva a sua volta altre proteine (p21) che bloccano il ciclo cellulare fino alla riparazione del danno.

55 Meccanismi di risposta cellulare al danno del DNA Se il danno del DNA non viene riparato P53 attiva altre proteine che determinano apoptosi (morte cellulare programmata). Difetti del gene TP53 sul cromosoma 17 che codifica per P53 causano una sindrome denominata Sindrome di Li-Fraunemi. Nelle famiglie con Sindrome di Li-Fraunemi si osservano numerosi casi di differenti tumori ad esordio prima dei 50 anni di vita

56 Mutazioni che non vengono riconosciute come tali e quindi non vengono corrette MALATTIE GENETICHE MALATTIE MOLECOLARI MALATTIE METABOLICHE Una malattia genetica è una patologia la cui causa è insita nel genoma dell'individuo; può essere dovuta alla presenza di uno o più alleli che producono polipeptidi con struttura e funzionalità anomala o alla mal regolazione nell'espressione di geni "normali". Una malattia molecolare è causata da un'anomalia o da una carenza di una particolare molecola Una malattia metabolica è un alterazione più o meno grave delle reazioni chimiche endocellulari e dei loro sistemi di controllo mutazione protoncogeni Proteine che controllano la replicazione e il differenziamento cellulare oncogeni cancro Perdita del controllo dell attività proliferativa Gli oncogeni e i geni oncosoppressori sono geni che in condizioni normali sono coinvolti nella regolazione della crescita delle cellule: gli oncogeni stimolano la proliferazione cellulare, mentre gli oncosoppressori la inibiscono.

57 VIRUS ONCOGENI: Presenza nel loro genoma di un oncogene derivato dal trasferimento di una parte di un protooncogene proveniente dal genoma di una cellula eucariotica parassitata. Dopo l infezione, la proteina codificata dall oncogene del genoma virale, inizia a svolgere la sua funzione, portando ad un aumento della riproduzione cellulare, che non viene più controllata