CARTA DEI SERVIZI LABORATORIO DI GENETICA MEDICA S.O.S MALATTIE RARE- S.O.D CLINICA PEDIATRICA

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1 0. INDICE 0. INDICE UBICAZIONE DEL LABORATORIO LO STAFF ATTIVITA Citogenetica Citogenetica Molecolare (FISH) Biologia Molecolare Consulenza Collegata Al Test MODALITA DI ACCESSO ALLE PRESTAZIONI Prenotazione Prelievi Pagamento Del Ticket Consulenza Pre-Test Consegna dei referti Privacy CERTIFICAZIONE STANDARD DI QUALITÀ CONTROLLI DI QUALITÀ ELENCO DELLE PRESTAZIONI TIPOLOGIA DI CAMPIONI INDICAZIONI ALL ANALISI Cariotipo da sangue periferico Cariotipo da liquido amniotico, villi coriali o sangue fetale Cariotipo da biopsia cutanea Cariotipo da sangue midollare Analisi CGH-array FISH In postnatale:... 10

2 In prenatale: In oncoematologia: Analisi molecolare del gene CFTR (Fibrosi cistica) Test di metilazione PW/Ang MODALITÀ DI PRELIEVO Modalità di prelievo liquido amniotico Modalità di prelievo villi coriali Modalità di prelievo di materiale abortivo Modalità di prelievo sangue periferico per analisi citogenetiche e FISH Modalità di prelievo sangue periferico per analisi molecolari (fibrosi cistica, estrazione DNA, test di metilazione) Modalità di prelievo sangue periferico per CGH-array Modalità di prelievo di campioni onco-ematologici MODALITÀ DI CONSERVAZIONE, TRASPORTO E CONSEGNA DEI CAMPIONI Liquido amniotico e villi coriali materiale abortivo sangue periferico analisi citogenetiche e/o molecolari Sangue midollare URGENZE TEMPI DI REFERTAZIONE ROUTINE TEMPI DI REFERTAZIONE URGENZE... 14

3 Il Laboratorio di Genetica Medica dell Azienda Ospedaliero-Universitaria Ospedali Riuniti di Ancona fa parte della Struttura Semplice MALATTIE RARE diretta dalla Dr.ssa Anna Ficcadenti. La S.O.S. Malattie Rare è inserita nella Struttura Complessa CLINICA PEDIATRICA diretta dal Prof. Orazio Gabrielli che è parte integrante del DIPARTIMENTO MATERNO-INFANTILE. La Mission del Laboratorio di Genetica Medica è quella di offrire prestazioni di alta specializzazione in citogenetica prenatale, postnatale ed oncoematologica ed in biologia molecolare per la diagnosi e la prevenzione delle malattie genetiche. UBICAZIONE DEL LABORATORIO Presidio G. Salesi Padiglione D terzo piano Via Corridoni, 11 ANCONA 1. LO STAFF Dirigenti: Dr. Giancarlo Discepoli Medico, Responsabile settore Oncoematologia Dr.ssa Antonella Pettinari Biologo, Responsabile settore Diagnosi Prenatale Dr.ssa Paola Piermattei Biologo, Responsabile settore Citogenetica Postnatale e Biologia molecolare Dr.ssa Anna Maria Ciaschni Biologo, Responsabile settore CGH-array Dr. Francesco Pigliapoco Biologo, settore Diagnosi Prenatale Dr.ssa Fabiola Tiberi Biologo, contrattista Tecnici di Laboratorio: Sabrina Bartolucci Veronica Bramucci Manuela Candelari Paola Sperandio Monica Vichi 2. ATTIVITA 2.1 Citogenetica Le analisi citogenetiche consentono lo studio dell assetto cromosomico delle cellule e quindi del cariotipo e l individuazione di piccole alterazioni strutturali dei cromosomi; l attività prevede l effettuazione di indagini

4 diagnostiche volte all identificazione delle anomalie cromosomiche costituzionali (citogenetica costituzionale), acquisite (citogenetica acquisita). 2.2 Citogenetica Molecolare (FISH) La citogenetica molecolare prevede lo studio di regioni cromosomiche specifiche attraverso tecniche che sfruttano il legame tra una sonda molecolare, (costituita da un frammento di DNA, specifico per la regione di interesse, marcato con composti fluorescenti), e la sequenza di DNA complementare del preparato che è stato fissato e montato su un vetrino portaoggetti. La tecnica dell Ibridazione in situ fluorescente (FISH) è la tecnica di citogenetica molecolare attualmente in uso nel Laboratorio di Genetica Medica e viene applicata di routine all analisi del cariotipo, ma solo nei casi selezionati in base a specifici sospetti diagnostici o per approfondire determinate anomalie citogenetiche. 2.3 Biologia Molecolare Le indagini di genetica molecolare consistono nello studio del DNA le cui alterazioni possono essere correlate o responsabili di un particolare fenotipo; attraverso l analisi molecolare è quindi possibile individuare mutazioni del patrimonio genetico responsabili di malattie ereditarie e/o varianti polimorfiche. 2.4 Consulenza Collegata Al Test I Dirigenti del Laboratorio di Genetica Medica (Medici e Biologi) sono tutti specializzati in Genetica Medica e pertanto autorizzati a svolgere consulenze genetiche pre e post-test relative alla analisi che vengono condotte presso il Laboratorio. I Dirigenti del Laboratorio svolgono anche colloqui informativi relativi a patologie genetiche che possono essere indagate su cellule preparate presso il Laboratorio di genetica ed inviate a laboratori specializzati. 3. MODALITA DI ACCESSO ALLE PRESTAZIONI 3.1 Prenotazione Per gli utenti esterni è necessaria la prenotazione da effettuare telefonicamente al numero dal martedì al giovedì dalle ore alle ore Al momento della prenotazione non è necessario essere già in possesso della richiesta del Medico di medicina Generale o dello specialista che dovrà invece essere presentata al momento del prelievo.

5 3.2 Prelievi I prelievi per i pazienti esterni vengono eseguiti presso il centro Prelievi del Presidio Salesi che si trova in una palazzina all interno del cortile del Presidio ospedaliero (ore ). E possibile richiedere la spedizione del referto a domicilio previa compilazione del modulo di autorizzazione. 3.3 Pagamento Del Ticket Il pagamento del ticket si effettua, dopo aver effettuato il prelievo al Centro Prelievi, presso l Ufficio Cassa al piano terra del Presidio Salesi in contanti o bancomat. Esenzioni: sono esenti i pazienti già in possesso di un certificato di esenzione totale per malattia rara o per reddito come indicato dalla vigente normativa. 3.4 Consulenza Pre-Test Viene effettuata dai Dirigenti del Laboratorio presso il Laboratorio stesso dalle ore 8.15 alle ore 10.30, dopo aver effettuato il prelievo e dopo il pagamento del Ticket. Durante la consulenza pre-test vengono illustrati agli utenti sia l Informativa relativa al trattamento dei dati secondo la normativa vigente che l informativa relativa all analisi che verrà condotta nel caso specifico e vengono raccolti i consensi. 3.5 Consegna dei referti I referti possono essere ritirati presso il Laboratorio secondo le indicazioni fornite durante la consulenza. Se al momento del prelievo è stata richiesta la spedizione il referto verrà inviato al domicilio indicato. Al momento del ritiro del referto è necessario presentare il documento di riconoscimento o delega dell interessato. 3.6 Privacy Al fine di garantire la riservatezza delle persone che effettuano gli esami, il Laboratorio di Genetica si attiene alle seguenti indicazioni: - il referto è consegnato in modo da garantire la totale riservatezza del contenuto; - il referto viene consegnato ad una persona diversa dal diretto interessato esclusivamente in presenza di delega scritta. Al momento del ritiro del referto è sempre presente un medico o un biologo al quale rivolgersi nel caso in cui si desiderino chiarimenti.

6 4. CERTIFICAZIONE L orientamento alla qualità coinvolge, in un processo di miglioramento, l intera attività del Laboratorio di Genetica allo scopo di migliorarne l efficienza e l efficacia in relazione alla soddisfazione dell utente / paziente e delle parti interessate al processo. A tale scopo il laboratorio di Genetica Medica ha sviluppato il proprio sistema di gestione orientato alla Qualità secondo il modello UNI EN ISO 9001:2008 Sistemi di gestione per la qualità e si è certificata nel Marzo 2014 nell ambito del Sistema di Qualità dell Azienda Ospedali Riuniti-Ancona. 5. STANDARD DI QUALITÀ Il Laboratorio di Genetica Medica opera in riferimento agli standard qualitativi del disciplinare della Società Italiana di Genetica Umana (SIGU) finalizzati ad un miglioramento continuo della qualità delle prestazioni offerte dalle Strutture di Genetica Medica a garanzia dei cittadini ed anche a tutela di tutti i professionisti del settore ed in riferimento alle linee guida e alle raccomandazione delle Società Scientifiche. 6. CONTROLLI DI QUALITÀ La qualità del risultato dell analisi è assicurata attraverso controlli sistematici. Il Laboratorio di Genetica Medica partecipa a controlli esterni di qualità (VEQ), per i settori Citogenetica e Molecolare, effettuati sia dall Istituto Superiore di Sanità che, a livello europeo, rispettivamente da Cytogenetics European Quality Assessment (CEQA) e dal Cystic Fibrosis European Network (CF Network). 7. ELENCO DELLE PRESTAZIONI - Cariotipo da sangue periferico + coltura di linfociti - Cariotipo da sangue fetale +coltura di linfociti - Cariotipo da liquido amniotico + coltura di amniociti - Cariotipo da villi coriali + coltura a breve e a lungo termine di villi coriali - Cariotipo da sangue midollare (o altri tessuti) + coltura di cellule midollari (o altri tessuti) - Cariotipo da biopsia cutanea + coltura di fibroblasti - Cariotipo da materiale abortivo + coltura di fibroblasti o di cellule del trofoblasto - Cariotipo da sangue periferico ad alta risoluzione +coltura di cellule sincronizzate - Cariotipo da sangue periferico per ricerca mosaicismo - Ibridazione in situ in fluorescenza (FISH) - Ricerca di 32 mutazioni della Fibrosi Cistica con metodo PCR/OLA - Test di metilazione Prader Willi-Angelman

7 - CGH-array postnatale - Estrazione DNA - Crioconservazione di cellule in azoto liquido - Consulenza pre-test e post-test 8. TIPOLOGIA DI CAMPIONI Sangue periferico Sangue fetale Materiale abortivo Sangue midollare Biopsia cutanea Biopsia linfonodale Liquido amniotico Villi coriali 9. INDICAZIONI ALL ANALISI 9.1 Cariotipo da sangue periferico L analisi del cariotipo da sangue periferico permette di identificare la eventuale presenza di anomalie cromosomiche costituzionali sia di numero che di struttura fino ad un minimo di dimensioni di 5-10 Mb. L analisi è indicata in: - fenotipo riconducibile ad una sindrome cromosomica nota - genitori e familiari di soggetti con anomalie cromosomiche - soggetti con difetti congeniti e/o ritardo mentale - soggetti con ritardo di accrescimento - nati morti e nati vivi deceduti in epoca neonatale, in particolare se presenti dismorfismi/malformazioni - genitori di soggetti malformati o con sospetta sindrome cromosomica, deceduti senza diagnosi - coppie con poliabortività (due o più aborti spontanei) - maschi infertili - femmine con amenorrea primaria, secondaria o menopausa precoce

8 - soggetti con sospetto clinico di sindrome da microdelezione/microduplicazione - soggetti con genitali ambigui - coppie con riscontro di cariotipo fetale con riarrangiamento cromosomico - femmine con patologia recessiva legata all X 9.2 Cariotipo da liquido amniotico, villi coriali o sangue fetale L analisi del cariotipo da liquido amniotico, villi coriali o sangue fetale permette di identificare la eventuale presenza di anomalie cromosomiche costituzionali fetali sia di numero che di struttura fino ad un minimo di dimensioni di 5-10Mb. L analisi è indicata in donne con rischio aumentato di patologia cromosomica fetale: - età materna 35 anni; - precedente figlio affetto da una anomalia cromosomica; - genitore portatore di una anomalia cromosomica strutturale bilanciata; - genitore portatore di un marcatore cromosomico sovrannumerario; - genitore con mosaicismo cromosomico; - anomalie fetali e segni predittivi evidenzati ecograficamente; - indagini biochimiche sul siero materno suggestive di un aumento del rischio di patologia cromosomica nel feto; - altre condizioni, da valutare in sede di consulenza genetica Situazioni particolari devono essere valutate singolarmente con appropriata consulenza multidisciplinare, che prenda in esame i rischi genetici del caso in oggetto e i rischi connessi con il prelievo di cellule fetali. 9.3 Cariotipo da biopsia cutanea L analisi del cariotipo da biopsia cutanea permette di identificare la eventuale presenza di anomalie cromosomiche costituzionali sia di numero che di struttura fino ad un minimo di dimensioni di 5-10Mb. E indicata nelle seguenti condizioni: - presenza di una condizione di mosaico riscontrata su altro tessuto (es. sangue periferico) - diagnosi di specifiche sindromi nelle quali l anomalia cromosomica non si riscontra su sangue periferico ( es. Pallister-Killian) - cariotipo in un soggetto con aplasia midollare o altre condizioni che non consentono l utilizzo del sangue periferico

9 - cariotipo su nati o neonati morti 9.4 Cariotipo da sangue midollare Consente la ricerca di anomalie cromosomiche acquisite in ogni caso di patologia oncoematologica con localizzazione midollare. Sono considerati tessuti analoghi anche altri tessuti se hanno localizzazione di malattia, ad esempio: sangue periferico, biopsie linfonodali, liquor, liquido pleurico. Le anomalie cromosomiche hanno valore diagnostico, rappresentano un utile fattore prognostico, in alcuni casi orientano le scelte terapeutiche, costituiscono dei marcatori per eventuale monitoraggio. 9.5 Analisi CGH-array La tecnica dei CGH-Microarray (Comparative Genomic Hybridization) (o cariotipo molecolare) ha la capacità di analizzare l'intero genoma. La elevata risoluzione di questa tecnica permette di rilevare riarrangiamenti criptici, non visibili con la citogenetica classica e molecolare, causativi della malattia. La tecnica viene applicata alla genetica costituzionale in tutti quei pazienti (con cariotipo normale) affetti da: - ritardo psicomotorio / deficit intellettivo idiopatico - malattie dello spettro autistico idiopatico - due o più malformazioni maggiori da causa non nota soprattutto se coinvolgenti viso, mani e cuore - riarrangiamenti cromosomici apparentemente bilanciati con anomalie fenotipiche Ulteriori indicazioni associate a ritardo psicomotorio e/o anomalie fenotipiche: - disturbi comportamentali - deficit di attenzione iperattività - epilessia - microcefalia - malformazione maggiore - anomalie di crescita (deficit od eccesso) 9.6 FISH L Ibridazione In Situ (FISH = Fluorescent In Situ Hybridization - Ibridazione In Situ) è una metodica che consente di definire con precisione numerose alterazioni cromosomiche. A seconda dei casi si possono studiare le metafasi o i nuclei interfasici. Tutti i tipi cellulari possono essere utilizzati per questo test.

10 9.6.1 In postnatale: - ogni volta che è necessario caratterizzare anomalie cromosomiche evidenziate dalla citogenetica convenzionale su indicazione del Consulente genetista o del Dirigente del settore postnatale del Laboratorio di Genetica - sospetto clinico di Sindromi da microdelezione (es. S. di Williams) o microduplicazione - sospetto clinico di mosaicismo per aneuploidie (es. S. di Down) In prenatale: - ogni volta che è necessario caratterizzare anomalie cromosomiche evidenziate dalla citogenetica convenzionale su indicazione del Consulente genetista o del Dirigente del settore prenatale del Laboratorio di Genetica - sospetto ecografico di Sindromi da microdelezione (es. S. di George) - su amniociti non coltivati: screening rapido delle aneuploidie per i cromosomi 13,18,21 e XY In oncoematologia: - alla diagnosi ogni volta che è necessario chiarire o confermare anomalie cromosomiche evidenziate dal cariotipo convenzionale. - alla diagnosi in caso di patologie specifiche con citogenetica convenzionale non valutabile. - alla diagnosi in patologie specifiche su segnalazione del reparto inviante: Mieloma, Leucemia Linfatica Cronica, Linfomi. - durante i trattamenti per verificare la risposta alla terapia. 9.7 Analisi molecolare del gene CFTR (Fibrosi cistica) Permette la ricerca delle mutazioni più frequenti (test I livello) del gene CFTR per la diagnosi di portatore sano o di affetto da Fibrosi Cistica. E indicato in: - soggetti con sospetto di patologia (test del sudore positivo; segni clinici) - genitori / familiari di soggetti affetti da FC - genitori / familiari di soggetti portatori di mutazioni del gene CFTR - soggetti afferenti ai centri di Procreazione Medicalmente Assistita 9.8 Test di metilazione PW/Ang Il Test di metilazione permette di diagnosticare la S. di Prader Willi o la S. di Angelman causate da microdelezione del cromosoma15 o da disomia uniparentale del cromosoma 15. E indicato in:

11 - soggetti con sospetto clinico di S. di Prader Willi - soggetti con sospetto clinico di S. Angelman 10. MODALITÀ DI PRELIEVO Il laboratorio di Genetica Medica riceve campioni, oltre che da utenti esterni, anche da pazienti ricoverati o in regime di day-hospital o ambulatoriali di SOD interne all Azienda Ospedali Riuniti o di altri Ospedali regionali o extra-regionali. Per le analisi su liquido amniotico, villi coriali e midollo osseo è necessario rivolgersi agli specialisti di Ostetricia o Ematologia che effettuano i prelievi dei relativi campioni secondo le seguenti modalità Modalità di prelievo liquido amniotico Ogni campione di liquido amniotico per l analisi del cariotipo deve essere di circa 20ml (minimo 10ml) e dell alfa-fetoproteina deve essere contenuto in 2 provette sterili da 15ml di polistirene graduate, coniche con tappo a vite. Se e richiesta anche l analisi FISH è necessario inviare anche una terza provetta contenente circa 3ml di liquido. Le provette devono essere contrassegnate da un etichetta recante nome e cognome della paziente, data di nascita e data del prelievo. In caso di liquido ematico è consigliabile aggiungere al momento del prelievo alcune gocce di eparina Modalità di prelievo villi coriali Ogni campione di villi coriali dopo lavaggio in terreno di coltura o fisiologica sterile effettuato in sede di prelievo, deve essere contenuto in provetta sterile da 15ml di polistirene coniche con tappo a vite, la quantità non deve essere inferiore a 10mg. Le provette devono essere contrassegnate da un etichetta recante nome e cognome della paziente, data di nascita e data del prelievo Modalità di prelievo di materiale abortivo Per l analisi del cariotipo fetale in caso di aborto è indicato inviare al Laboratorio preferibilmente frustolo placentare (villi coriali) o un frammento di cute fetale e/o di cordone ombelicale prelevati sterilmente e conservati in fisiologica sterile in provetta o barattolino sterile contrassegnati da un etichetta recante nome e cognome della paziente, data di nascita, data del prelievo.

12 10.4 Modalità di prelievo sangue periferico per analisi citogenetiche e FISH I campioni devono essere prelevati con sistema vacutainer utilizzando una provetta contenente sodioeparina (litio-eparina) cristallizzata. In presenza di coaguli il campione non è idoneo. Le provette devono essere contrassegnate da un etichetta recante nome e cognome del paziente, data di nascita e data del prelievo Modalità di prelievo sangue periferico per analisi molecolari (fibrosi cistica, estrazione DNA, test di metilazione) I campioni devono essere prelevati con sistema vacutainer utilizzando una provetta contenente EDTA. In presenza di coaguli il campione non è idoneo. Le provette devono essere contrassegnate da un etichetta recante nome e cognome del paziente, data di nascita e data del prelievo Modalità di prelievo sangue periferico per CGH-array Per ogni paziente si utilizzano due provette, una per eventuale analisi citogenetica e una per analisi molecolare di CGH-array. Per l analisi citogenetica: i campioni devono essere prelevati con sistema vacutainer utilizzando una provetta contenente sodio-eparina (litio-eparina) cristallizzata. Per l analisi molecolare: i campioni devono essere prelevati con sistema vacutainer utilizzando una provetta contenente EDTA. Per entrambi i tipi di prelievo le provette devono essere contrassegnate da un etichetta recante nome e cognome del paziente, data di nascita e data del prelievo. In presenza di coaguli il campione non è idoneo Modalità di prelievo di campioni onco-ematologici A) il midollo osseo va aspirato con siringa eparinata (non usare altri anticoagulanti; limitare l'eparina al minimo: quella che rimane nel becco della siringa dopo averne aspirata un poco e aver vuotato la siringa stessa); la siringa può anche essere chiusa e inviata direttamente oppure il contenuto può essere trasferito subito in provetta sterile, identificate con nome e cognome del paziente (analogamente per il sangue periferico). La quantità, necessaria e sufficiente, è di 3 ml considerando una cellularità media ed un campionamento corretto (# è comunque inutile aspirare una quantità maggiore di midollo poiché risulterebbe diluito da sangue periferico, # è auspicabile effettuare l'aspirazione da una puntura ossea apposita e non usare lo stesso punto per aspirare midollo per lo striscio, per la tipizzazione immunologica, per il cariotipo, etc.).

13 B) le biopsie linfonodali o di masse linfomatose vanno messe in un contenitore con una garza bagnata di soluzione fisiologica (il tutto deve essere sterile) (evitare assolutamente formalina o altri fissativi, non occorrono antibiotici) e tenute a temperatura ambiente. C) il sangue periferico è utile solo nel caso in cui vi siano presenti, in numero adeguato (non inferiore a 2000/mmc), cellule appartenenti alla linea clonale patologica. 11. MODALITÀ DI CONSERVAZIONE, TRASPORTO E CONSEGNA DEI CAMPIONI Liquido amniotico e villi coriali I campioni devono essere consegnati al Laboratorio di Genetica entro 24 ore dal prelievo e devono essere conservati e trasportati a temperatura ambiente (non inferiore a 15 C e non superiore a 30 C) materiale abortivo I campioni devono essere consegnati al Laboratorio di Genetica entro 48 ore dal prelievo e devono essere conservati a 5±3 C e trasportati a temperatura ambiente sangue periferico analisi citogenetiche e/o molecolari I campioni devono essere consegnati al Laboratorio di Genetica entro 48 ore dal prelievo e devono essere conservati a 5±3 C e trasportati a temperatura ambiente Sangue midollare I campioni di sangue midollare e/o periferico per analisi citogenetiche oncoematologiche devono giungere al Laboratorio di Genetica al più presto dopo il prelievo e comunque entro 24 ore dal prelievo. Tutti i campioni devono essere consegnati al Laboratorio di Genetica dalle ore 8 alle ore 15 dal lunedì al venerdì. Il sabato vengono accettati solo campioni urgenti previ accordi telefonici con il personale del Laboratorio. Tutti i campioni dovranno essere accompagnati da - consenso all analisi - consenso al trattamento dei dati personali e genetici - modulo recante i dati paziente, data prelievo, l indicazione all analisi, le informazioni cliniche e la firma del medico prelevatore 12. URGENZE

14 Tutte le prestazioni urgenti devono essere preventivamente concordate telefonicamente con il Laureato Genetista responsabile dell analisi e saranno accettate il primo giorno utile ai fini dell esecuzione del test. 13. TEMPI DI REFERTAZIONE ROUTINE INDAGINE Cariotipo da colture di amniociti e da colture a lungo termine di trofoblasto Cariotipo da colture di linfociti Cariotipo da colture di fibroblasti da biopsia cutanea Cariotipo da colture di midollo osseo Cariotipo da coltura a breve termine di trofoblasto FISH postnatale FISH prenatale Array-CGH/SNP postnatale Fibrosi cistica Estrazione DNA Test di metilazione TEMPO 21 giorni giorni 28 giorni giorni 7 giorni giorni 4 giorni 8-24 settimane 20giorni 10giorni 8-30 giorni 14. TEMPI DI REFERTAZIONE URGENZE INDAGINE Cariotipo da colture di amniociti e da colture a lungo termine di trofoblasto Cariotipo da colture di linfociti Cariotipo da colture di fibroblasti da biopsia cutanea FISH su di midollo osseo non coltivato Cariotipo da coltura a breve termine di trofoblasto FISH postnatale FISH prenatale Array-CGH/SNP postnatale Fibrosi cistica Estrazione DNA TEMPO 14giorni 7 giorni 14giorni 2 giorni 5 giorni 4 giorni 4 giorni 2 settimane 5 giorni 5 giorni