Metodi spettroscopici

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1 Metodi spettroscopici Si basano sullo studio e la valutazione (misura) delle variazioni di energia che si hanno in seguito ad interazione tra una radiazione elettromagnetica e la materia (nuclei, atomi o molecole). Classificazione: Si possono dividere generalmente in metodi di assorbimento (attenuazione di un fascio di radiazione) e di emissione (radiazione emessa dall analita in particolari condizioni sperimentali) Spettroscopie ottiche: assorbimento-emissione UV-visibile (UV-Vis) luminescenza (fluorescenza, fosforescenza) spettroscopia infrarossa (IR), Raman Spettroscopie magnetiche: risonanza magnetica nucleare, NMR risonanza elettronica di spin, ESR Scattering: diffrazione raggi X scattering neutronico 1

2 Metodi spettroscopici Classificazione: Più in dettaglio vengono classificati in base alla regione dello spettro elettromagnetico coinvolta 2

3 Applicazioni nell analisi farmaceutica Rilascio dei farmaci Analisi quantitativa Spettroscopia UV/Vis Cinetica di degradazione Saggi FU Coefficienti di ripartizione e solubilità 3

4 Metodi spettroscopici La radiazione elettromagnetica è una forma di energia che viene trasmessa nello spazio ad elevate velocità - può essere descritta sia in termine di onde che di particelle Modello ondulatorio: la radiazione è prodotta dal movimento periodico di una carica elettrica che genera campi elettrici (E) e magnetici (H) oscillanti con andamento sinusoidale, tra loro perpendicolari, che si propagano linearmente nel mezzo con velocità dipendente dal mezzo stesso. E H 4

5 Metodi spettroscopici Parametri di un onda lunghezza d onda (λ) - distanza fra due punti successivi in fase tra loro (due massimi o due minimi) - si misura in unità di lunghezza, Es. μm = 10-6 m; nm = 10-9 m; Å = m frequenza (ν) - numero di oscillazioni al secondo, cioè numero di onde che transitano per un punto in un secondo - si misura in Hz (Hertz - cicli per secondo) ampiezza (A) - massima intensità del vettore campo elettrico rispetto all asse di propagazione (correlata all intensità (I) della radiazione - energia che l onda trasporta in 1 secondo attraverso una superficie di area unitaria perpendicolare alla direzione di propagazione). Numero d onda ( ) - numero di onde per centimetro - si misura in cm -1 Relazione tra i parametri d onda ν = c λ c = velocità della luce nel vuoto 3x10 10 cm/sec = 1 / λ 5

6 Metodi spettroscopici Modello corpuscolare Descrive la radiazione elettromagnetica come un flusso di «pacchetti energetici» fotoni o quanti. detti Equazione di Einstein-Plank: E = hν = hc λ = hc c = velocità della luce nel vuoto 3x10 10 cm/sec; h = costante di Planck (6.62x10-27 erg sec); ν = frequenza espressa in Hz L energia di una radiazione elettromagnetica è direttamente proporzionale alla frequenza e inversamente proporzionale alla lunghezza d onda 6

7 Metodi spettroscopici Le interazioni delle radiazioni elettromagnetiche con le molecole può indurre: Variazione della frequenza di rotazione della molecola intorno ad un loro asse (transizioni rotazionali) Variazione della frequenza di vibrazione a carico di un legame tra due atomi (transizioni vibrazionali) La transizione di un elettrone di valenza nel caso di atomi o di un elettrone di un orbitale molecolare nel caso di molecole, da un livello interno ad uno più esterno (transizioni elettroniche) I tre tipi di transizioni si ottengono con energie molto diverse: - transizione elettronica - indotta da energie corrispondenti a radiazioni nel campo UV-VIS; - transizioni vibrazionali - indotte da radiazione a minore contenuto energetico e appartenenti allo spettro infrarosso; - transizioni rotazionali - indotte da radiazioni nel campo delle microonde 7

8 Emissione e assorbimento di luce Gli atomi, gli ioni o le molecole di un campione di materia possiedono un numero limitato di livelli energetici discreti e quantizzati il più basso dei quali è chiamato stato fondamentale (E 1 ) L eccitazione verso uno o più livelli superiori (E 2 ) si realizza fornendo energia al campione Il periodo di vita di una specie eccitata è breve, ed il decadimento verso un livello energetico più basso o verso lo stato fondamentale è accompagnato dalla perdita di energia sotto forma di calore, radiazione fluorescente o fosforescente M + hγ M* Assorbimento M* M1 + Δ + hγ Emissione 8

9 Gli spettri prodotti possono essere: Di righe Atomi eccitati allo stato gassoso A bande Molecole eccitate che esistono in una grande quantità di stati di eccitazione con energie che differiscono di poco 9

10 Nella spettroscopia di assorbimento atomico sono coinvolte transizioni elettroniche che riguardano gli elettroni negli orbitali di valenza degli atomi o ioni allo stato gassoso. Ad ogni livello elettronico possono essere associati più livelli vibrazionali e ad ognuno di questi più livelli rotazionali. Gli elettroni coinvolti nelle transizioni possono essere di tipo s, p o d. Orbitali interessati alla transizione elettronica: HOMO: Highest occupied molecular orbital, quindi è elettroni a più alta energia. l'orbitale molecolare contenete LUMO: Lowest Un-occupied molecular orbital cioè l'orbitale molecolare vuoto a più bassa energia. 10

11 In spettroscopia atomica l analita è presente sotto forma di nube atomica. Non essendo significative vibrazioni e rotazioni, lo spettro atomico è a righe, non a bande (una banda è l inviluppo di numerosissime righe). Spettro luce bianca Emissione Elio Emissione Litio 11

12 Nella spettroscopia di assorbimento molecolare sono coinvolte transizioni elettroniche che riguardano gli elettroni negli orbitali molecolari. Gli elettroni coinvolti possono essere elettroni su orbitali di legame (, π) che vengono promossi su orbitali di antilegame ( *, π*) oppure elettroni presenti su orbitali di non legame, non impegnati in un legame molecolare (n) (es. gli elettroni non condivisi dell ossigeno dei gruppi carbonilici) che vengono promossi su orbitali di antilegame ( *, π*) 12

13 La lunghezza d onda necessaria alle diverse transizioni è tanto maggiore quanto minore è il dislivello di energia. Le transizioni σ σ* sono molte energetiche (l < 200 nm) quelle π π* e n π* sono meno energetiche e avvengono nella regione UV- Visibile. 13

14 n * corrisponde alla promozioni di un elettrone di non legame n ad uno di antilegame * (es. eteri, ammine, solfuri, alogenuri). Le transizioni n * possono dare luogo ad assorbimento a λ diverse, a seconda della natura dell eteroatomo: alcoli ed eteri assorbono nell UV lontano e sono quindi trasparenti nella zona di lunghezza d onda > 180 nm; ammine, solfuri, alogenuri assorbono nell UV vicino a causa del fatto che i loro rispettivi elettroni di non legame sono trattenuti meno stabilmente nei corrispondenti orbitali atomici di non legame 14

15 π π* transizioni molto intense osservabili all UV. All aumentare del numero di doppi legami coniugati i composti possono assorbire fino al visibile. Composti che contengono un solo doppio legame etilenico, triplo legame di tipo acetilenico o nitrilico danno luogo a transizioni π π* nell UV lontano, mentre composti contenenti gruppi carbonilici (aldeidi-chetoni), carbossilico, azo, nitro, nitroso, nitrato, nitrito danno transizioni π π* nel vicino UV (λ > 200 nm) Le bande π π* si suddividono in: K o di coniugazione - sistemi π molto delocalizzati come sistemi aromatici e coniugati λ nm ; ε > 10 4 B o benzenoide aromatici, banda classica benzene, non permessa dalla restrizioni di simmetria e quindi poco intensa λ = 270nm; ε > 10 2 E o etilenica tipica di sistemi π insaturi non coniugati λ= nm; ε=2x

16 n π* sono transizioni molto deboli ma facilmente osservabili perché hanno minor contenuto energetico e cadono a lunghezza d onda più alta di qualsiasi altra transizione. Solo le transizioni n π*, e π π* radiazioni nel range nm hanno energie tali da poter essere promosse da Regole di selezione Solo alcune transizioni elettroniche sono permesse e alcune sono più probabili. La regola di selezione principale stabilisce che sono permesse solo le transizioni che comportano separazione di carica (il sistema si comporta come un dipolo elettrico oscillante). una molecola può assorbire energia solo se i momenti dipolari elettrici dello stato eccitato e di quello fondamentale sono diversi da 0 16

17 L assorbimento UV presenta bande generalmente molto larghe, perché sono costituite dalla sovrapposizione di transizioni vibrazionali e rotazionali. 17

18 Uno spettro UV-Vis si ottiene tipicamente facendo passare della luce di una lunghezza d onda definita (luce monocromatica) attraverso una soluzione diluita in un solvente non-assorbente. L intensità della banda di assorbimento si misura come la percentuale di luce incidente che passa attraverso il campione (trasmittanza T) ossia il rapporto tra il potere radiante della radiazione trasmessa e quello della radiazione incidente T = I / I 0 0 < T < 1 T% =100 I / I 0 0 < T% < 100 I = intensità della luce trasmessa I 0 = intensità della luce incidente. 18

19 L assorbimento può essere espresso anche come Assorbanza A = log 1 / T = log I 0 / I 0 < A < Legge di Lambert-Beer A I0 log ( ) I c l c = concentrazione dell analita (Molarità) l = lunghezza del cammino ottico (cm) ε = coefficiente di estinzione molare (M -1 cm -1 ) Riportando l assorbanza A o la trasmittanza T o T% in funzione della lunghezza d onda (λ) si ottengono gli spettri di assorbimento 19

20 La legge di Lambert-Beer è valida per radiazioni monocromatiche e soluzioni diluite (< 10-2 M) in modo che A sia compresa tra 0 e 2. All'aumentare della concentrazione aumenta il numero di particelle in soluzione ed aumenta anche il numero di urti fra queste; le forze interioniche e/o intermolecolari aumentano e possono formarsi molecole o aggregati di particelle più complesse, diverse per struttura da quelle in esame, per cui si potrà avere uno spostamento del massimo di assorbimento. ε dipende dall indice di rifrazione del mezzo che, per concentrazioni elevate, dipende a sua volta dalla concentrazione. Radiazione incidente non perfettamente monocromatica 20

21 Deviazioni reali dalla legge di Lambert-Beer La legge è strettamente applicabile a soluzioni in cui le interazioni, dipendenti dalla concentrazione, tra le molecole o gli ioni assorbenti sono minime. La legge è rispettata per soluzioni diluite (<0.01 M) Ad alte concentrazioni (>0.01 M) la distanza media fra le specie assorbenti è diminuita a tal punto che ogni particella influisce sulla distribuzione di carica di quelle vicine 21

22 Deviazioni chimiche Si tratta di deviazioni apparenti. Quando la sostanza assorbente va incontro ad associazione, dissociazione o reazione con il solvente per dare prodotti con caratteristiche diverse da quelle dello stesso analita. Es: Cr 2 O 7= + H 2 O 2HCrO 4-2H + + CrO 4 = La forma gialla CrO 4= assorbe a 375 nm, la forma (rossa-arancio) Cr 2 O 7= presenta due λ max a 350 nm e 450 nm Supponendo di aver effettuato una misura ad un certo ph (i.e. ph = 1) a 350nm o 450 nm, dopo aver diluito 1:10 si può verificare che l assorbanza non risulta 10 volte più piccola del valore iniziale ma mostra un valore ancora più basso Questo fenomeno è dovuto alla modifica del ph per diluizione. Se il ph è sufficientemente elevato il cromo è presente tutto sotto forma di CrO = 4 L assorbanza di Cr 2 O 7= si abbassa dato che la sua concentrazione diminuisce sia per azione diretta della diluizione che per effetto dell equilibrio 22

23 Deviazioni strumentali La legge di Lambert-Beer è una relazione limite, nel senso che una vera linearità tra assorbanza e concentrazione esige l uso di una radiazione esattamente monocromatica All atto pratico, comunque, deviazioni significative alla legge si hanno soltanto quando la banda di radiazioni usata comprende una regione dello spettro in cui ci sono grandi variazioni di assorbanza in funzione di λ. 23

24 Strumentazione 1. Sorgente di radiazione policromatica 2. Selettore di lunghezza d onda (Filtri o Monocromatore) 3. Compartimento campione 4. Rivelatore Elaboratore del segnale con registratore La regione utilizzata è nm (vicino UV) e nm (visibile). Al disotto dei 200nm è necessaria una strumentazione con il banco ottico sottovuoto per eliminare l ossigeno presente nell aria che assorbe a queste lunghezze d onda. 24

25 Strumentazione: sorgenti Le lampade sono di tipo diverso per le differenti regioni spetrali Devono emettere in modo continuo senza cali di potenza. Visibile - si usano lampade ad incandescenza (a filamento di tungsteno o lampade tungsteno-alogeno che forniscono energie più elevate nell intervallo nm). UV - si usano lampade a scarica riempite di idrogeno o deuterio: il deuterio viene eccitato dalle scariche elettriche prodotte da un arco ed emette uno spettro continuo di radiazioni al di sotto di 400 nm. Lampada tungstenoalogeno Lampada al D 2 25

26 Strumentazione: Selettori di lunghezze d onda Hanno lo scopo di selezionare una banda ristretta di radiazioni costituita da un gruppo continuo e limitato di lunghezze d onda A. Filtri ad assorbimento o ad interferenza B. Monocromatori a prisma o a reticolo La qualità di un monocromatore è definita da due parametri AMPIEZZA DELLA BANDA PASSANTE: Intervallo di lunghezze d onda del fascio che emerge dalla fenditura con un energia superiore al 50% dell energia della radiazione nominale (espressa in nm) POTERE RISOLVENTE (RISOLUZIONE SPETTRALE): Capacità del monocromatore di separare fra loro due diverse lunghezze d onda R = / l = differenza tra due lunghezze d onda l = distanza in mm misurata sul piano della fenditura di uscita del monocromatore Una radiazione di 580 nm (nominale), di un monocromatore con banda passante di 20 nm, comprende anche le radiazioni fra 570 nm e 590 nm (intensità pari alla metà di quella nominale). 26

27 Strumentazione: Selettori di lunghezze d onda Filtri ad assorbimento o ad interferenza I più comuni sono i filtri di assorbimento e vengono utilizzati nei colorimetri più economici. Sono in vetro e non possono essere utilizzati per analisi nell UV. Hanno bassa trasmittanza percentuale e banda passante solitamente elevata (minimo 30 nm). I filtri ad interferenza sono più costosi, hanno una maggiore trasmittanza percentuale, e stretta banda passante (10nm) 27

28 Strumentazione: Selettori di lunghezze d onda Monocromatore - costituiti da fenditura d ingresso specchio o lente di collimazione elemento disperdente (prisma o reticolo) specchio o lente di focalizzazione piano focale fenditura d uscita 28

29 Strumentazione: Selettori di lunghezze d onda Monocromatore a prisma La dispersione viene realizzata per rifrazione del raggio (le componenti vengono rifratte in funzione della diversa ) Non sono più usati, in maniera particolare su strumenti di maggiore qualità. La lente collimatrice rende paralleli i raggi in ingresso al prisma. Il prisma opera la dispersione e i raggi da esso in uscita vengono focalizzati separatamente sul piano focale. Spostando la fenditura di uscita si seleziona la radiazione della desiderata 29

30 Strumentazione: Compartimento campione Le celle o cuvette tipicamente sono a forma di parallelepipedo a sezione quadrata con cammino ottico di 1 cm. L interno può essere anche cilindrico. Per campioni molto diluiti sono disponibili celle da 4 cm e per campioni molto concentrati ci sono celle con cammino ottico di 1 o 2 mm. La cella deve essere trasparente alla regione spettrale utilizzata nell analisi vetro per il visibile polistirene (monouso) per il visibile Quarzo per l UV-Vis Solitamente le cuvette hanno due facce ottiche (attraverso le quali passa la radiazione) e due facce (opache) che servono per maneggiarle. Le facce ottiche devono essere perfettamente pulite ed asciutte 30

31 Strumentazione: Compartimento campione Gli spettri UV-Vis sono effettuati in soluzione. Il sovente adatto deve: Solubilizzare il campione Essere trasparente nella regione spettrale utilizzata - la λ al disotto della quale il solvente assorbe è detto cutoff. Poiché gli spettri UV-Vis si eseguono a partire da 200nm, per il vicino UV sono da evitare solventi contenenti carbonili, sistemi coniugati, aromatici. Si dovrebbe scegliere il solvente che permette di conservare la struttura fine delle bande di assorbimento Se possibile si dovrebbero evitare solventi che formano leg H o comunque solventi troppo polari 31

32 Strumentazione: Compartimento campione 32

33 Strumentazione: Rivelatori Servono a trasformare la radiazione trasmessa dal compartimento campione in un segnale elettrico facilmente amplificabile e registrabile. Fototubi (basati sull effetto fotoelettrico) Costituito da un fotocatodo, di grande area, e da un anodo; gli elettrodi sono contenuti in un'ampolla di vetro sottovuoto, avente una finestra di quarzo e sono sottoposti ad un'elevata differenza di potenziale. Quando i fotoni colpiscono il catodo (fotoemittente) causano la fuoriuscita di elettroni, che accelerati dalla differenza di potenziale tra i due elettrodi si muovono verso l'anodo. La raccolta degli elettroni da parte dell'anodo permette di ottenere una corrente elettrica linearmente proporzionale all intensità della radiazione luminosa. 33

34 Strumentazione: Rivelatori Fotomoltiplicatori. Variante dei fototubi, caratterizzati da una sensibilità superiore; gli elettroni emessi dal catodo vengono accelerati da un campo elettrico e focalizzati verso una seconda superficie fotoemissiva (dinodo); quando la colpiscono provocano l emissione di un numero di elettroni superiore; gli elettroni cosi liberati colpiscono i dinodi successivi in modo da amplificare il segnale. Il rapporto di amplificazione (guadagno) può arrivare fino a 109 e per ogni fotone incidente 34

35 Strumentazione: strumenti a singolo raggio Esiste un unico raggio che va dalla sorgente, attraverso il campione, al rilevatore. È necessario quindi analizzare prima il bianco ed azzerare il segnale di assorbimento rilevato. In questo modo la successiva analisi del campione produce un valore di assorbanza dovuto esclusivamente all analita. Usati prevalentemente in analisi qualitativa. Lo strumento deve essere azzerato prima di ogni serie di misure per eliminare l assorbimento dovuto al solvente e/o alla matrice in cui l analita è disperso. Con questo tipo di strumento, occorre eseguire l azzeramento ad ogni misura e ad ogni λ, oppure registrare prima lo spettro del bianco, poi lo spettro del campione ed infine sottrarre al secondo il primo. 35

36 Strumentazione: strumenti a doppio raggio Il raggio uscente dal monocromatore viene sdoppiato mediante un chopper: i due raggi ottenuti di intensità I 0 vengono inviati rispettivamente al campione e al bianco posti in due cuvette uguali su due cammini ottici separati. Il raggio emergente dal bianco avrà intensità I B di poco o nulla alterata (assorbimento minimo o nullo) e verrà considerato come I 0, mentre il raggio uscente dal campione avrà una intensità I C < I 0. Le due intensità I C e I 0 raggiungono il rivelatore alternativamente. Il sistema di registrazione è sincronizzato con il motore del chopper in modo da sapere se sta registrando I C o I B. Grazie a queste caratteristiche è possibile effettuare misure direttamente a qualsiasi λ senza ripetere gli azzeramenti. 36

37 Strumentazione 37

38 Applicazioni Analisi qualitativa Lo spettro di assorbimento molecolare ottenuto dipende dalla struttura elettronica della molecola che assorbe. Ausilio alle altre tecniche spettroscopiche e chimiche nell identificazione dell analita Analisi quantitativa La proporzionalità diretta tra la concentrazione dell analita e l assorbanza osservata (legge di Lambert-Beer) permette di effettuare determinazioni quantitative dell analita presente 38

39 Analisi qualitativa Cromoforo - gruppo funzionale organici insaturi Vis. (i.e. C=O; -C=C-; Ph) che assorbe la radiazione nell UV- Transizioni n * e π π* Effetti sulla banda di assorbimento La coniugazione tra due (o più) cromofori tende a provocare spostamenti verso più elevate dei massimi di picco 39

40 Analisi qualitativa Shift Batocromico (red shift) spostamento a λ maggiori e ν minori Diminuzione dell energia di transizione realizzato da sostituenti che provocano sia un aumento dell energia dell orbitale legante che una diminuzione dell energia dell orbitale antilegante (o viceversa) 40

41 Analisi qualitativa Shift Ipsocromico (blue shift) spostamento a λ minori e ν maggiori Aumento dell energia di transizione realizzato da sostituenti che provocano sia una diminuzione dell energia dell orbitale legante ed un aumento dell energia dell orbitale antilegante (o viceversa) 41

42 Analisi qualitativa Effetto ipercromico aumento di ε - assorbimento maggiore Aumento del valore di ε sia per l aumentata probabilità di transizione sia per l aumentata superficie 42

43 Analisi qualitativa Effetto ipocromico diminuzione di ε - assorbimento minore 43

44 Analisi qualitativa: Fattori che influenzano la posizione e l intensità dell assorbimento Presenza di un gruppo auxocromo - gruppi funzionali saturi (-OH, -NH 2,-Cl) direttamente legati al cromoforo che provocano lo spostamento del massimo di assorbimento verso λ maggiori a causa della coniugazione degli elettroni n nel cromoforo esistente. Si osserva anche un aumentano di ε in quanto con la coniugazione aumenta il momento dipolare associato alla coniugazione e si ha una maggiore interazione con la radiazione elettromagnetica. Effetto solvente - cambiando la polarità del solvente si può avere spostamento ipsocromico o batocromico in funzione della natura della transizione e delle interazioni soluto-solvente. L effetto del solvente dipende dalla differenza di polarità tra stato fondamentale e stato eccitato. Se lo stato eccitato e più polare dello stato fondamentale un solvente polare facilita la transizione (aumento di ε); se lo stato eccitato è meno polare dello stato fondamentale il solvente polare ostacola la transizione (diminuzione di ε). 44

45 Analisi qualitativa Si possono ottenere informazioni sulla presenza di sistemi aromatici e di sistemi con doppi e tripli legami coniugati; si può avere un idea del numero, tipo e posizione dei sostituenti legati al sistema aromatico o coniugato. Assorbimenti molto forti (ε = ) nella zona di nm indicano la presenza di almeno due cromofori coniugati - più la banda è spostata verso il visibile più è estesa la coniugazione Assorbimenti forti (ε = ) nella zona nm indicano la presenza di sistemi aromatici con sostituenti polari Assorbimenti deboli o di media forza (ε = ) nella zona nm indicano la presenza di sistemi aromatici con sostituenti alchilici o la presenza di atomi con elettroni di non legame (transizioni n *) Assorbimenti molto deboli (ε = ) nella zona nm indicano la presenza di gruppi C=O, N=N, N=O, C=S. (transizioni n π*) 45

46 Analisi qualitativa Spettroscopia di assorbimento L effetto dei sostituenti sulla posizione e sull intensità della banda di assorbimento può essere abbastanza precisamente previsto applicando regole empiriche ricavate dall osservazione degli spettri UV-Vis di composti noti con strutture coniugate di diverso tipo. Queste regole sono note come Regole di Woodward-Fieser e sono state ricavate per tre differenti tipi di cromofori DIENI CONIUGATI DIENONI CONIUGATI O O SISTEMI AROMATICI Il procedimento consiste nel partire dal valore di λ max caratteristico di una struttura base ed aggiungere i contributi dovuti ai vari sostituenti del sistema coniugato. 46

47 Analisi qualitativa: Regole di Woodward-Fieser 47

48 Analisi qualitativa: Regole di Woodward-Fieser Dieni coniugati Hanno due possibili transizioni π π* di cui una sola è osservabile nel vicino UV - la conformazione cis ha un più alto contenuto energetico quindi la differenza di energia tra HOMO e LUMO è inferiore assorbimento a λ maggiori trans π * 4 π * 3 π nm 175 nm 217 nm 253 nm cis π 1 Banda di assorbimento molto intensa (ε > 20000) poco influenzata dal solvente e molto dalla presenza di sostituenti e dall estensione della coniugazione 48

49 Analisi qualitativa: Regole di Woodward-Fieser Dieni coniugati aciclici Basate sulla banda di riferimento a 217 nm per il cromoforo del trans-1,3-butadiene A cui si somma il contributo di ogni singolo sostituente o caratteristica strutturale Group Increment Extended conjugation +30 Each exo-cyclic C=C +5 Alkyl +5 -OCOCH OR +6 -SR +30 -Cl, -Br +5 -NR

50 Analisi qualitativa: Regole di Woodward-Fieser 50

51 Analisi qualitativa: Regoledi Woodward-Fieser Dieni coniugati ciclici Due principali tipi di dieni ciclici, con differenti valori base Eteroanulari (transoidi):omoanulari (cisoidi): e = 5,000 15,000 e = 12,000-28,000 base λ max = 214 base λ max = 253 Si hanno gli stessi incrementi che per i dieni aciclici, in più: Addizionale omoanulare +39 nm Se sono presenti due tipi di dieni, quello con λ maggiore diventa quello base 51

52 Analisi qualitativa: Regole di Woodward-Fieser 52

53 Analisi qualitativa: Regole di Woodward-Fieser Dieni coniugati ciclici 53

54 Analisi qualitativa: Regole di Woodward-Fieser Enoni I composti carbonilici hanno tre transizioni possibili (n *, n π* e π π* ) solo quella n π* cade sopra i 200 nm. Bisogna considerare l effetto auxocromo del sostituente sulla posizione della banda di assorbimento n π*. Quando l idrogeno dell aldeide viene sostituito con altri sostituenti si osserva un effetto ipsocromico anche molto considerevole. Si spiega considerando le capacità induttive elettron-attrattrici del sostituente che attraverso il carbonio carbonilico fa aumentare la forza con cui l ossigeno carbonilico attira a se gli elettroni del lone pair, rendendoli meno disponibili per la transizione O O O O H CH 3 Cl NH nm O O 204 O OH

55 Analisi qualitativa: Regole di Woodward-Fieser Enoni Quando il carbonile è coniugato si osserva uno shift batocromico delle transizioni n π* e π π* e anche la transizione π π* cade nel UV-Vis. Si osserva che lo shift batocromico è più pronunciato per la transizione π π* Per questo motivo le regole empiriche di Woodward-Fieser si applicano alla transizione π π* 55

56 Analisi qualitativa: Regole di Woodward-Fieser Enoni C C C O C C C C C O Group Increment 6-membered ring or acyclic enone 5-membered ring parent enone Acyclic dienone Base 215 nm Base 202 nm Base 245 nm Double bond extending conjugation 30 Alkyl group or ring residue,, and higher 10, 12, 18 -OH,, and higher 35, 30, 18 -OR,,, 35, 30, 17, 31 -O(C=O)R,, 6 -Cl, 15, 12 -Br, 25, 30 -NR 2 95 Exocyclic double bond 5 Homocyclic diene component 39 56

57 Analisi qualitativa: Regole di Woodward-Fieser Enoni Unsaturated system Base Value Aldehyde 208 With or alkyl groups 220 With, or, alkyl groups 230 With,, alkyl groups 242 Acid or ester With or alkyl groups 208 With, or, alkyl groups 217 Group value exocyclic, double bond +5 Group value endocyclic, bond in 5 or 7 membered ring +5 Per questi composti sono previste anche delle correzioni da introdurre per considerare l effetto del solvente. L acqua favorisce la transizione e da shift batocromici. Solventi apolari sfavoriscono la transizione e danno shift ipsocromici Solvent correction Increment Water +8 Ethanol, methanol 0 Chloroform -1 Dioxane -5 Ether -7 Hydrocarbon

58 Analisi qualitativa: Regole di Woodward-Fieser Enoni 58

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62 Analisi qualitativa: Regole di Woodward-Fieser Composti Aromatici I composti aromatici presentano diverse bande di assorbimento nell ultravioletto. Comuni a tutti i sistemi che contengono un anello benzenico sono tre bande relative a transizioni π - π* : E 1 a 184 nm (ε = 60000) E = etilenica E 2 a 203 nm (ε = 7400)(K) B a 254 nm (ε = 204) B = benzenica La banda B ha una struttura fine anche in soluzione a causa della presenza di sottolivelli vibrazionali. Dal punto di vista analitico si utilizza principalmente la banda B; quando l effetto batocromico dei sostituenti sposta la banda E 2 a λ maggiori anche questa viene considerata per la caratterizzazione strutturale 62

63 Analisi qualitativa: Regole di Woodward-Fieser Composti Aromatici Benzene: Possiede il più semplice tipo di cromoforo detto benzenoide, caratterizzato da una banda forte a 184nm (e = 56000) e due più basse a 204 e 256 nm (e = 7900 e 250 rispettivamente) 63

64 Analisi qualitativa: Regole di Woodward-Fieser Composti Aromatici, effetto dei sostituenti Anche per i composti aromatici esistono delle tabelle che permettono di apportare correzioni alla λ della banda B in funzione del tipo di sostituente. Non sempre i risultati ottenuti trovano riscontro preciso con il valore sperimentale (ci sono più eccezioni che regole) In generale si può dire: La presenza di gruppi alchilici induce effetto batocromico La coniugazione con doppi o tripli legami o con altri anelli aromatici induce effetto batocromico La presenza di sostituenti con elettroni di non legame (lone pair come -OH, -NR 2, -NO 2 ) dà la possibilità di transizioni n - π* e induce effetti batocromici ed ipercromici. 64

65 Analisi qualitativa: Regole di Woodward-Fieser Composti Aromatici, effetto dei sostituenti 65

66 Analisi qualitativa: Regole di Woodward-Fieser Composti Aromatici, effetto dei sostituenti 66

67 Analisi qualitativa: Regole di Woodward-Fieser Composti Aromatici, effetto dei sostituenti Quando il sistema aromatico è legato a sostituenti aventi proprietà acido base (- OH, -NR 2, -COOH) le variazioni del ph inducono variazioni nella posizione e nell intensità dell assorbimento. Fenoli - a ph alcalino aumenta la disponibilità a delocalizzare elettroni nell anello (ione fenato) e si ha un effetto batocromico e ipercromico rispetto al fenolo Aniline - a ph acido si ha la protonazione del lone pair e la sua indisponibilità a delocalizzarsi nell anello con perdita dell effetto batocromico e ipercromico Acidi carbossilici - in questi composti si ha effetto batocromico e ipercromico per la coniugazione del doppio legame del gruppo carbonilico con l anello aromatico. A ph alcalino si ha la dissociazione e formazione dello ione carbossilato che è caratterizzato da una forte coniugazione interna ed il gruppo carbonilico è meno disponibile alla coniugazione con l aromatico. Si riduce l effetto batocromico e ipercromico. 67

68 Analisi qualitativa: Regole di Woodward-Fieser Composti Aromatici, effetto del ph Analisi UV di fenoli e aniline OH O OMe OH max 270 nm = 1450 (shift batocromico) max 287 nm = 2600 max 269 nm = 1480 NH 2 NH 3 + H + max 280 nm = 1430 (shift ipsocromico) max 254 nm =

69 Analisi qualitativa: Regole di Woodward-Fieser Composti Aromatici, effetto dei sostituenti Quando ci sono due o più sostituenti è necessario considerare le caratteristiche di tutti. Se i sostituenti sono entrambi elettron-attrattori o elettron-donatori prevale l effetto del più forte e dal punto di vista UV il composto si comporta come se fosse mono-sostituito Se uno è elettron-attrattore e l altro elettron-donatore e sono in para l effetto finale è maggiore della somma dell effetto dei singoli gruppi. Questo si verifica a causa della coniugazione dei due gruppi tramite l anello aromatico. H 2 N Se i due gruppi con effetto dissimile sono in orto o in meta l effetto totale corrisponde alla somma dell effetto dei singoli gruppi. In meta non c è risonanza ed in orto c è disturbo sterico. N O O H 2 N N O O 69

70 Analisi qualitativa: Regole di Woodward-Fieser Composti Aromatici, effetto dei sostituenti Negli aromatici policondensati si ha uno shift batocromico che aumenta con il numero di anelli condensati. 70

71 Analisi qualitativa in derivata Spettroscopia di assorbimento Spettro di ordine zero Assorbanza in funzione di Spettri in derivata derivata 1 di A in funzione di derivata 2 di A in funzione di derivata 3 di A in funzione di derivata 4 di A in funzione di Aumento della risoluzione miglior separazione tra i massimi di assorbimento di due analiti in miscela Riduzione dell intensità del segnale 71

72 Analisi qualitativa in derivata 72

73 Applicazioni: Qualitative Determinazioni analitiche in campioni complessi Determinazioni spettrofotometriche in FU X Metodo di rivelazione associato a tecniche cromatografiche 73

74 Applicazioni: Determinazioni analitiche in campioni complessi L adrenalina è presente come vasocostrittore in alcuni preparati iniettabili usati per anestesia locale in concentrazione molte inferiore a quella dell anestetico locale stesso che maschera l assorbimento dell adrenalina stessa. La selettività dell analisi spettroscopica nei confronti dell adrenalina si può aumentare attraverso la formazione di un complesso fra il Fe 2+ e i gruppi catecolici. Si forma una specie (di colorazione porpora) che assorbe a 540 nm, ben oltre le lunghezze d onda alla quale assorbono gli anestetici locali 74

75 Applicazioni: Determinazioni analitiche in campioni complessi Saggio delle penicilline: Si utilizza la formazione di un derivato per eseguire la determinazione delle penicilline nelle formulazioni Queste molecole, quando sono in sospensione, non vengono facilmente estratte per separarle dagli eccipienti poiché sono abbastanza insolubili in solventi organici immiscibili con acqua Data l assenza di un cromoforo distintivo si genera un complesso con lo ione mercurio in presenza di imidazolo come catalizzatore 75

76 Applicazioni: Determinazioni spettrofotometriche in FU X Efedrina: Possiede uno spettro UV simile a quello del benzene con una debole banda non simmetrica a 260 nm. Come il benzene, presenta il suo massimo di assorbimento al di sotto dei 200 nm Non ci sono gruppi polari legati o coinvolti nel cromoforo quindi la struttura fine è mantenuta in quanto il cromoforo stesso non interagisce fortemente con il solvente 76

77 Analisi qualitativa: Determinazioni spettrofotometriche in FU X Ketoprofene: Il cromoforo benzenoide è stato esteso da 4 doppi legami (uno carbonilico e tre benzenici) con alterazione della simmetria dell anello. La forte banda di assorbanza presente nel benzene a 204nm subisce un forte shift batocromico sovrapponendosi a quella a 256 nm 77

78 Analisi qualitativa: Determinazioni spettrofotometriche in FU X Procaina: il cromoforo benzenoide è stato esteso per l aggiunta di un gruppo C=O, inoltre la presenza di un gruppo auxocromo (NH 2 ) provoca un effetto dipendente dal ph In condizioni acide ( HCl 0.1 M) mostra un assorbimento a λ max =279 nm A=100 ma in condizioni basiche (NaOH 0.1 M) ha un doppietto non condiviso e si osserva quindi anche un effetto ipercromico ed un valore di A=

79 Analisi qualitativa: Determinazioni spettrofotometriche in FU X Feniliefrina: Il cromoforo della fenilefrina non è esteso, ma esso comprende un ossidrile fenolico. Il gruppo fenolico funziona da auxocromo sia in condizioni acide che basiche In condizioni acide ha due doppietti elettronici non condivisi in grado di interagire con il benzene. In condizioni basiche ne ha tre. Si hanno shift batocromico ed ipercromico. 79

80 Analisi qualitativa: Determinazioni spettrofotometriche in FU X Feniliefrina: 80

81 Analisi qualitativa: Metodo di rivelazione associato a tecniche cromatografiche 81

82 Analisi qualitativa: Metodo di rivelazione associato a tecniche cromatografiche 82

83 Analisi qualitativa: Metodo di rivelazione associato a tecniche cromatografiche 83

84 Analisi qualitativa: Metodo di rivelazione associato a tecniche cromatografiche 84

85 Analisi qualitativa: Metodo di rivelazione associato a tecniche cromatografiche 85