Esame Prenatale Non Invasivo (NIPT) mediante analisi del DNA fetale libero da sangue materno

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1 Esame Prenatale Non Invasivo (NIPT) mediante analisi del DNA fetale libero da sangue materno

2 E un test prenatale non invasivo (NIPT) che, analizzando il DNA fetale libero circolante isolato da un campione di sangue materno, rileva aneuploidie fetali comuni in gravidanza, quali: Trisomia 21 (Sindrome di Down) Trisomia 18 (Sindrome di Edwards) Trisomia 13 (Sindrome di Patau) Monosomia X (Sindrome di Turner) XXX (Trisomia X) Cos è XXY (Sindrome di Klinefelter) XYY (Sindrome di Jacobs) Il test prevede anche un livello di approfondimento che consente di valutare aneuploidie e alterazioni cromosomiche strutturali (delezioni e duplicazioni) fetali a carico di ogni cromosoma, con risultati molto simili all analisi del cariotipo fetale mediante tecniche invasive di diagnosi prenatale.

3 analizza il DNA fetale libero circolante nel sangue materno Campione di sangue materno DNA libero di origine materna DNA libero di origine fetale

4 Il DNA fetale libero (cfdna) circolante nel sangue materno Durante la gravidanza, alcuni frammenti del Dna del feto circolano nel sangue materno. Il DNA fetale è rilevabile a partire dalla 5 settimana di gestazione. La sua concentrazione aumenta nelle settimane successive e scompare subito dopo il parto. La quantità di DNA fetale circolante dalla 10 settimana di gestazione è sufficiente per garantire l elevata specificità e sensibilità del test.

5 Origine del DNA fetale libero (cfdna) Il DNA fetale libero consiste in corti frammenti di DNA (~145/200 bp) presenti nel plasma in percentuali variabili a seconda del periodo gestazionale Viene rilasciato, attraverso il processo dell apoptosi (morte cellular programmata) Origina dai trofoblasti placentari.

6 Caratteristiche del test

7 PrenatalSafe : Tecnologia FAST ad Alta Risoluzione Risultato in 3 giorni Grazie alla recente introduzione della innovativa tecnologia FAST ad elevata profondità di lettura (~30 milioni di sequenze), è possibile ottenere i risultati dell'esame dopo soli 3 giorni lavorativi, mantenendo i medesimi parametri di sensibilità e specificità del test. La procedura FAST è attualmente applicabile solo ai test: PrenatalSafe 3 (aneuploidie dei cromosomi 21, 18, 13 e sesso fetale) PrenatalSafe 5 (aneuploidie dei cromosomi 21, 18, 13, X, Y); PrenatalSafe Karyo (analisi del cariotipo fetale).

8 Test eseguito da GENOMA

9 Maggiore accuratezza rispetto al Bi-test I test di screening del primo trimestre (Bi-Test) presentano un incidenza del 5% di falsi positivi, comportando un aumento significativo di esami invasivi non necessari, e non rilevano il 5-15% dei casi di trisomia 21 (falsi negativi)

10 Indicazioni all esecuzione del test Gravidanze in cui è controindicata la diagnosi prenatale invasiva (es. rischio di aborto spontaneo) Screening del primo trimestre (Bi-Test) positivo Età materna avanzata (>35 anni) Quadro ecografico di anomalie fetali suggestive di aneuploidia Anamnesi personale/familiare di anomalie cromosomiche Partner(s) della coppia portatore(i) di traslocazione cromosomica bilanciata. Gravidanze a basso rischio (casistica limitata)

11 A chi è dedicato il test A tutte le donne in gravidanza con un età gestazionale di almeno 10 settimane gravidanze singole ottenute mediante: concepimento naturale tecniche di fecondazione assistita omologhe tecniche di fecondazione assistita eterologhe gravidanze gemellari ottenute mediante: concepimento naturale tecniche di fecondazione assistita omologhe tecniche di fecondazione assistita eterologhe precedenti gravidanze andate a termine precedenti gravidanze esitate in aborto spontaneo o seguite da interruzione volontaria di gravidanza

12 prevede 5 livelli di indagine

13 PrenatalSafe 3 rileva le principali trisomie fetali Il test PrenatalSafe rileva le trisomie 21, 18 e 13 sia nelle gravidanze singole che in quelle gemellari Cromosomi Trisomia o Trisomia 18 Trisomia XX-sesso femminile XY-sesso maschile

14 prevede 5 livelli di indagine

15 PrenatalSafe 5 rileva anche le aneuploidie dei cromosomi sessuali Il test PrenatalSafe 5 rileva sia le trisomie 21, 18 e 13, che le aneuploidie dei cromosomi sessuali (solo nelle gravidanze singole). Nelle gravidanze gemellari, viene rilevata la presenza o l assenza del cromosoma Y. Cromosomi Trisomia o Trisomia 18 Trisomia XX-sesso femminile XY-sesso maschile XXX Monosomia X XXY XYY

16 prevede 5 livelli di indagine

17 Esame Prenatale Non Invasivo del Cariotipo Fetale

18 Che cos è E il test prenatale non invasivo (NIPT) tecnologicamente più avanzato e rappresenta una evoluzione dei tradizionali test di screening non invasivi che analizzano il cfdna da sangue materno Prenatalsafe Karyo rileva: Aneuploidie fetali (sia quelle comuni in gravidanza che quelle meno frequenti); Alterazioni cromosomiche strutturali fetali (delezioni e duplicazioni segmentali) a carico di ogni cromosoma del cariotipo fetale E un test prenatale non invasivo (NIPT) che consente di studiare il cariotipo fetale Il nuovo test prenatale non invasivo per lo studio del cariotipo fetale

19 Il test prenatale non invasivo che studia il cariotipo fetale Nessun altro NIPT oggi disponibile offre un livello d indagine così avanzato. Gli altri test prenatali non invasivi analizzano solamente alcuni cromosomi fetali, quali i cromosomi 21, 18, 13, X e Y.

20 prevede 2 livelli di indagine

21 Detection rate Il test evidenzia il 92.6% delle anomalie cromosomiche fetali rilevabili in epoca prenatale, ed il 96.2% di quelle riscontrate alla nascita

22 Livello di detection rate molto simile al cariotipo fetale tradizionale

23 Cariotipo fetale tradizionale vs

24 prevede 2 livelli di indagine

25 Plus Detection rate Il test evidenzia il 95.5% delle anomalie cromosomiche fetali rilevabili in epoca prenatale, ed il 99.1% di quelle riscontrate alla nascita

26 Livello di detection rate molto simile Plus al cariotipo fetale tradizionale

27 Cariotipo fetale tradizionale vs Plus E consigliabile ricorrere all utilizzo del PrenatalSafe Karyo Plus solo in determinati contesti clinici (esempio dubbi ecografici suggestivi di sindrome da microdelezione cromosomica)

28 Studi di validazione pubblicati

29 Esempi di casi clinici

30 Esempio di un recente caso clinico (Caso 1) Paziente di 31 anni 12^ settimana di gestazione 5 Risultato Negativo 20^ settimana di gestazione Anomalie fetali ecografiche (ipoplasia del cervelletto; ventricolomegalia) Amniocentesi Rianalisi con

31 Chr. 5 Identifica una delezione 5p confermata con array-cgh Chr. 5 Del5p Mb Liquido Amniotico cfdna Array-CGH PrenatalSafe Karyo

32 Esempio di un recente caso clinico (Caso 2) Paziente di 32 anni 13^ settimana di gestazione 5 Risultato Negativo Anomalie fetali ecografiche 21^ settimana di gestazione (difetto interventricolare, piede torto, intestino iperecogeno, dismorfismo facciale, arteria ombelicale unica) Amniocentesi

33 Chr. 18 Identifica due delezioni (18p e 18q) confermate con array-cgh Chr. 18 Del18p11.32-p ,8 Mb Liquido Amniotico cfdna Del18q21.32-q23 21,3 Mb Array-CGH PrenatalSafe Karyo

34 Esempio di un recente caso clinico (Caso 3) Paziente di 32 anni Portatrice di traslocazione reciproca 46,XX,t(7;9)(p15;q22) Gravidanza ottenuta con PMA 11^ settimana di gestazione Chr. 7 Chr. 9 Risultato Patologico rilevato cariotipo fetale con traslocazione sbilanciata Anomalie fetali ecografiche (labiopalatoschisi; idrocefalia tetraventricolare, ipoplasia cuore) 12^ settimana di gestazione Villocentesi Risultato confermato

35 Identifica una traslocazione sbilanciata confermata con array-cgh Dup7p22.3p Mb Dup9p24.3-q Mb Array-CGH PrenatalSafe Karyo Array-CGH PrenatalSafe Karyo Villi Coriali cfdna Villi Coriali cfdna

36 Esempio di un recente caso clinico (Caso 4) Paziente di 35 anni Amniocentesi (cariotipo tradizionale) 13^ settimana di gestazione Risultato Negativo (Cariotipo fetale 46, XY) Anomalie fetali ecografiche (Sospetta Sindrome di DiGeorge) 20^ settimana di gestazione Sindrome di DiGeorge Amniocentesi

37 Identifica una gravidanza con Plus sindrome di DiGeorge Chr.22 Del22q11.21 Sindrome di DiGeorge 4 Mb Liquido Amniotico cfdna Array-CGH PrenatalSafe Karyo

38 Esempio di un recente caso clinico (Caso 5) Chr. 13 Chr. 20 Paziente di 33 anni (non consapevole di essere portatrice di traslocazione cromosomica) 12^ settimana di gestazione Risultato Patologico rilevato cariotipo fetale con delezione 13q33.1q34 di 11.4 Mb Anomalie fetali ecografiche (Igroma Cistico e Sacci Giugulari) Paziente portatrice di traslocazione reciproca 46,XX,t(13;20)(q33;q13.3) Villocentesi 15^ settimana di gestazione Risultato confermato

39 Del13q33.1q34 Identifica una traslocazione sbilanciata di origine materna 11.4 Mb Dup20q Mb Chr. 13 Chr. 20 PrenatalSafe Karyo (cfdna) Array-CGH (CVS) PrenatalSafe Karyo (cfdna) Array-CGH (CVS)

40 Esempio di un recente caso clinico (Caso 6) Paziente di 40 anni 11^ settimana di gestazione Risultato Patologico rilevata duplicazione 18p Villocentesi 12^ settimana di gestazione Risultato confermato

41 Chr. 18 Identifica una duplicazione 18p confermata con array-cgh

42 Esempio di un recente caso clinico (Caso 7) Paziente di 38 anni 10^ settimana di gestazione Risultato Patologico rilevata duplicazione 11p Amniocentesi 16^ settimana di gestazione Risultato confermato

43 Identifica una duplicazione 11p confermata con array-cgh Chr. 11 Dup11p15.4p Mb Liquido Amniotico Dup11p15.4p Mb cfdna Array-CGH PrenatalSafe Karyo

44 Esempio di un recente caso clinico (Caso 8) Paziente di 40 anni NIPT (screening 5 cromosomi) Risultato Positivo Alto Rischio per Trisomia 21 13^ settimana di gestazione Esame eseguito da altro laboratorio Trisomia 21 non rilevata Rilevata CNV materna Identificata causa del risultato Falso Positivo riportato dal test eseguito da altro laboratorio

45 Riduce il rischio di falsi positivi determinati da CNV materni Array-CGH Prelievo ematico gestante PrenatalSafe Karyo cfdna

46 Riduce il rischio di falsi positivi determinati da CNV materni

47 Chudova et al., 2016 NEJM Riduce il rischio di falsi positivi determinati da CNV materni

48 Studio Prospettico

49 Background Conventional cfdna-based NIPT approaches focus on detection of common trisomies and sex-chromosome aneuploidies. This leaves a gap of approximately 17% of clinically relevant chromosomal/subchromosomal abnormalities that would go undetected. Previous studies have shown the potential of extending conventional NIPT to detect fetal microdeletion syndromes from maternal plasma (Peters et al., 2011; Srinivasan et al., 2013). Other studies showed how genome-wide cfdna testing can contribute in lowering the incidence of false positive results generated by maternal copy number variants (Snyder et al., 2015; Chudova et al., 2016). At present, there are limited data available on the potential of genome-wide screening to detect rare autosomal trisomies and structural chromosome anomalies in a general population of pregnant women.

50 Aim of the study From December 2015 through February 2016, genome-wide cell-free fetal DNA (cfdna) testing was offered to pregnant women undergoing conventional cfdna-based non-invasive prenatal testing (NIPT) for common fetal aneuploidy. We aimed to compare the performance of the two test in a general obstetrical population.

51 Demographic and pregnancy characteristics Characteristics n No. of eligible patients 7163 Maternal age-yr - Mean ±SD 35.1±4.5 - Min-max Gestational age at sample collection -wk - Mean ±SD 12.7±2.2 - Min-max Indications for NIPT - Parental Anxiety 2264 (31.6%) - Advanced maternal age a 2622 (36.6%) - Positive prenatal screen 673 (9.4%) - Fetal ultrasound abnormality 279 (3.9%) - Prior pregnancy with fetal aneuploidy 79 (1.1%) - More than one indication 1246 (17.4%)

52 Results of samples tested Total No. of patients analyzed 7163 Samples with a call - no. (%) 7142 (99.7) Total cancellations - no. (%) 115 (1.6) - Samples with low FF - no. (%) 93 (1.3) - Samples with test failure - no. (%) 22 (0.3) Samples with a conclusive result - no. (%) 7048 (98.1) Chromosomally abnormal results - Genome-wide cfdna screening - no. (%) 128 (1.8) - Conventional cfdna screening - no. (%) 105 (1.8) Pregnancies confirmed as chromosomally abnormal - no. (%) - Genome-wide cfdna screening - no. (%) 107 (1.5) - Conventional cfdna screening - no. (%) 93 (1.3)

53 Clinically relevant chromosomal abnormalities classes detected by genome-wide cfdna analysis Number of anomalies Trisomy 21 Trisomy 18 Trisomy 13 Monosomy X (X0) Triple X Syndrome (XXX) Klinefelter Syndrome (XXY) Jacobs Syndrome (XYY) Rare Autosomal Trisomies Structural anomalies - CNV

54 Types of chromosome anomalies detected by conventional and genome-wide cfdna testing 13,1% 86,9% Common aneuploidies Chr. abnormalities not detected by standard cfdna testing

55 Performance of conventional cfdna screening vs. genome-wide analysis Conventional cfdna screening Genome-wide cfdna screening P-value No. of pregnancies assessed Clinical relevant chromosomal abnormalities detected - no. (%) Pregnancies confirmed as chromosomally abnormal - no. (%) False Positive False Negative 10^ 0 True Positive True Negative Sensitivity 90.29% % 0.001** Specificity 99.83% 99.70% Positive Predictive Value (PPV) 88.57% 83.59% 0.27 Negative Predictive Value (NPV) 99.86% % 0.016** ^ Clinically relevant chromosomal abnormalities, not detected by conventional cfdna screening, potentially resulting in the birth of babies with chromosomal anomalies, have been considered as false negative. A P-value of less than 0.05 was considered to indicate statistical significance (**).

56 Performance of the Genome-wide cfdna screening

57 Conclusion The clinical utility of expanding NIPT to cover the entire genome is controversial, especially in low-risk pregnancies. In fact, it pertains a risk of overdiagnosis with a higher number of false positives because of chromosomal rearrangements which are confined to the placenta, potentially leading to an increase in unnecessary invasive testing. The results of this study demonstrate that a high specificity may be maintained while extending the screen to all chromosomal abnormalities.

58 La tecnologia

59 La Tecnologia del test

60 l evoluzione tecnologica PrenatalSAFE utilizza la tecnologia avanzata di sequenziamento massivo parallelo (MPS) dell intero genoma umano, a differenza di altri test disponibili in commercio che invece impiegano una strategia diagnostica mirata, in cui il processo è limitato ai soli cromosomi 21, 18, 13, X e Y. Metodi di sequenziamento mirato (5 cromosomi) Analisi dell intero genoma mediante Sequenziamento Massivo Parallello (MPS)

61 Tecnologia di sequenziamento totale del genoma fetale

62 VeriSeq NIPT Analysis Software Le sequenze cromosomiche del DNA fetale vengono quantificate mediante sofisticate analisi bioinformatiche, al fine di determinare la presenza di eventuali aneuploidie cromosomiche. Per l analisi bioinformatica viene utilizzato il software VeriSeq, fornito in licenza esclusiva da Illumina / Verinata; Il software VeriSeq è marcato CE-IVD, e quindi utilizzabile per applicazioni cliniche diagnostiche in vitro, in conformità alla normativa Europea (Direttiva 97/79/CE) ed al D.lgs. 332/2000; (Example) Il software VeriSeq è stato validato su centinaia di migliaia di campioni clinici; Maggiore garanzia dei risultati.

63 VeriSeq NIPT Analysis Software

64 Tecnologia di nuova generazione Migliore qualità dei risultati Totale Automazione e High Throughput Procedura di laboratorio completamente automatizzata, dall estrazione del DNA all analisi dei dati Capacità di analisi di elevati volumi di campioni

65 Tecnologia di nuova generazione Migliore qualità dei risultati Maggiore risoluzione L introduzione del Sequenziamento bidirezionale (Paired-end) del genoma fetale raddoppia il numero di letture, migliorando l affidabilità del test.

66 Tecnologia di nuova generazione Migliore qualità dei risultati

67 Tecnologia di nuova generazione Migliore qualità dei risultati Determinazione della frazione fetale più accurata Differenziazione del DNA di origine fetale da quello materno in base alla differente lunghezza

68 Fiorentino et al., Prenatal Diagnosis (2016) 36: rileva le aneuploidie anche a bassa FF (<4%)

69 rileva le aneuploidie anche a bassa FF (<4%) Le linee guida Italiane e Internazionali* concordano nel dedicare particolare attenzione ai campioni a bassa frazione fetale in quanto ritenuti a maggiore rischio (da 4 a 10 volte) di aneuploidie cromosomiche *-Ministero della Salute. Linee-Guida Screening prenatale non invasivo basato sul DNA (Non Invasive Prenatal Testing NIPT). Maggio Committee Opinion No. 640: Cell-free DNA Screening for Fetal Aneuploidy. Obstet Gynecol 2015; 126:e Society for Maternal-Fetal Medicine (SMFM) Publications Committee #36: Prenatal aneuploidy screening using cell-free DNA. Am J Obstet Gynecol 2015;212: Benn P, Borrell A, Chiu RW, et al. Position statement from the Chromosome Abnormality Screening Committee on behalf of the Board of the International Society for Prenatal Diagnosis. Prenat Diagn 2015; 35: Fiorentino et al., Prenatal Diagnosis (2016) 36:

70 Fiorentino et al., Prenatal Diagnosis (2016) 36:

71 Performance procedura Standard

72 Performance procedura FAST

73 Fiorentino et al., EJHG conference 2016 Validazione pre-clinica del test

74 Performance casi clinici

75 Procedura e Servizi gratuiti

76 Procedura semplice ed intuitiva

77 Servizi gratuiti forniti con il test

78 Richiedi il test