Metodi spettroscopici per le Biotecnologie

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1 AA Metodi spettroscopici per le Biotecnologie Spettroscopia di emissione UV-VIS (2) Dott. Alfonso Zoleo

2 I percorsi possibili dallo stato eccitato In ragione della maggiore o minore probabilità di un certo processo fotofisico di diseccitazione possiamo definire una costante cine*ca di quel processo. Tanto più il processo è probabile, tanto maggiore è la sua costante cine=ca. I processi fotofisici di diseccitazione sono equazioni cine=che del primo ordine, ovvero dipendono dalla popolazione di molecole in quello stato ele@ronico

3 Equazioni cine,che per i processi fotofisici S Diseccitazione per fluorescenza da S a S 0 k radia*vo S 0 Conversione interna da S a S 0 S k IC termico S 0 Conversione ISC da S a T S k T ISC Molecole nello stato di singole@o S umero di molecole che lasciano lo stato S nell unità di tempo

4 Equazioni cine,che per i processi fotofisici T Diseccitazione per fosforescenza da T a S 0 k P radia*vo S 0 Conversione interna da T a S 0 T k TIC termico S 0 T Molecole nello stato di triple@o T umero di molecole che lasciano lo stato T nell unità di tempo

5 Intensità della fluorescenza Questo termine rappresenta le molecole che lasciano, nell unità di tempo, lo stato S per tornare nello stato S 0 eme@endo radiazione. Ogni molecola che va da S a S 0 in questo processo eme@e un fotone. Quindi il numero di fotoni emessi per fluorescenza nell unità di tempo, è k Come vengono emessi i fotoni nell emissione per fluorescenza? Ogni molecola che si diseccita, eme@e il fotone in una direzione casuale che dipende da come è orientata la molecola in quel momento In una soluzione di cromofori, le molecole sono poste in tu@e le orientazioni, e quindi i fotoni sono emessi con la stessa probabilità in ogni direzione dello spazio

6 Lampada Monocromatore Di eccitazione: fisso per selezionare la lunghezza onda del massimo di assorbimento Eccito a questa lunghezza d onda Luce alla lunghezza d onda del massimo di assorbimento Esperimento di fluorescenza I(λ) Le molecole, eccitate in seguito all assorbimento di un fotone, rieme@ono la luce in tu@e le direzioni. La luce emessa è policroma*ca (in ogni punto). Posso raccogliere lo spe@ro di emissione in un punto qualsiasi. Lo faccio a 90, così evito la luce di eccitazione Monocromatore Di emissione: lo ruoto, portando di volta in volta la rivelatore la luce emessa alle varie lunghezze d onda In questo modo faccio una scansione della luce emessa alle varie lunghezze d onda, misurandone l intensità La quan=tà che misuro è I(λ), cioè l intensità di luce emessa alla lunghezza d onda λ per ogni lunghezza onda dello spero di emissione Raccolgo tu@o lo spe@ro di emissione facendo una scansione della luce emessa ad ogni λ

7 Monocromatore di emissione Monocromatore di eccitazione Cella campione Lampada otomoltiplicatore

8 Esperimento di eccitazione Luce a lunghezza d onda variabile Lampada λ ex λ ex Monocromatore Di eccitazione: lo ruoto selezionando via via diverse lunghezze d onda di eccitazione Monocromatore Di emissione: lo tengo fisso, selezionando una sola lunghezza d onda di emissione λ Raccolgo ad una lunghezza d onda I(λ) La quan=tà che misuro è I(λ ecc ), cioè l intensità di luce emessa per ogni lunghezza onda di eccitazione, tenendo fissa la lunghezza d onda di fluorescenza accio una scansione su tu@e le lunghezze d onda di eccitazione. Lo spe@ro che o@engo è simile a quello di assorbimento, ma le intensità possono essere diverse per effe@o dei processi concorren= alla fluorescenza

9 Resa quan,ca di fluorescenza Questo termine rappresenta le molecole che lasciano, nell unità di tempo, lo stato S per tornare nello stato S 0 eme@endo radiazione. Ogni molecola che va da S a S 0 in questo processo eme@e un fotone. Quindi il numero di fotoni emessi per fluorescenza nell unità di tempo, è k Supponiamo di aver eccitato un certo numero di molecole allo stato S : come varia nel tempo l intensità della fluorescenza prodo@a da queste molecole? I d = Kk L intensità di fluorescenza ad un certo tempo è semplicemente dt K = proporzionale al numero di molecole nello stato di singole@o eccitato S Rammen=amo le tre equazioni cine=che che rappresentano le molecole che decadono da S per i vari processi: Quindi, il decadimento complessivo è dato da d dt = k k ISC k IC = ( k + k + k ) = k ISC IC tot

10 Risolvendo questa equazione differenziale, si oxene: ktot t ( t) = (0) e = (0) e t /τ tot τ tot =/k tot Quindi, il numero di molecole che si trova nello stato eccitato S decade esponenzialmente con il tempo (se nessuno ripopola lo stato S!). e consegue che anche l intensità della fluorescenza decade esponenzialmente con costante τ tot : /e τ tot t I ( t) = K d dt = Kk ( t) = Kk (0) e La costante τ tot è de@a tempo di vita effekvo della fluorescenza: Definiamo RESA QUATICA DI LUORESCEZA il rapporto tra le molecole che (nell unità di tempo) decadono da S per emissione di fluorescenza rispeko a quelle che decadono per tul i processi t /τ tot k k φ = = = tot k k tot τ τ tot τ = k è il tempo di vita «naturale» della fluorescenza Chiaramente, risulta sempre 0 φ

11 lash photolysis Impulso di luce campione Un impulso di luce (laser) molto più breve dei decadimen= che si vogliono misurare viene inviato sul campione producendo «istantaneamente» una popolazione di molecole eccitate. Un detector veloce registra la luce emessa in funzione del tempo. - - Possiamo misurare: il tempo di vita effexvo della fluorescenza Il tempo di vita effexvo della fosforescenza Poiché tu@e le molecole che decadono nei vari processi sono quelle che vengono eccitate dalla luce, possiamo calcolare la resa quan=ca di fluorescenza anche come φ=(n. molecole che fluorescono)/(n. molecole eccitate)=i /I A I = intensità della luce emessa per fluorescenza I A = intensità della luce assorbita

12 EffeKo solvente sugli spekri di fluorescenza Uno degli effex più u=li negli studi biologici è lo spostamento dello di fluorescenza allo di assorbimento in relazione alla polarità del solvente S Molecola in stato eccitato, ambiente di stato fondamentale Riorganizzazione delle molecole In un solvente apolare, o nel vuoto, la banda 0-0 dello spe@ro di assorbimento e dello spe@ro di emissione coincidono In un solvente polare la banda 0-0 dello spe@ro di assorbimento e dello spe@ro di emissione non coincidono, perché la banda 0-0 dello spe@ro di emissione è spostata a lunghezze d onda maggiori S Molecola in stato eccitato, ambiente in stato eccitato S 0 Molecola in stato fondamentale, ambiente di stato fondamentale Riorganizzazione delle molecole S 0 Molecola in stato fondamentale, ambiente in stato eccitato

13 Vantaggi della fluorescenza Elevata sensibilità: la fluorescenza può essere rilevata a concentrazioni nanomolari (talora perfino a singola molecola) Possibilità di operare «in vivo» Basso costo della strumentazione Ampia disponibilità di fluorofori biocompa=bili da usare come sonde Sensibilità del fluoroforo all ambiente Misura di distanze tra sonde di fluorescenza (labelling di biomolecole) Sonde endogene: luorofori (= molecole fluorescen=) naturalmente presen= nella biomolecola: es. triptofano, =rosina, fenilalanina in proteine Sonde esogene: luorofori aggiun= alla biomolecola: es. e=dio bromuro per DA/ RA,pirene in membrane, iso=ocianato di fluoresceina e dansil cloruro: legame covalente alla lisina delle proteine

14 luorescenza intrinseca di proteine Trp esposto ad ambiente acquoso fluoresce a 350 nm, mentre Trp sepolto nel core emette a 330 nm e con >intensità. Possibilità di studiare conformazione delle biomolecole/ cambi conformazionali Tyr contribuisce generalmente alla fluorescenza perché residui di tirosina sono spesso presenti in elevato numero luorescenza di Tyr può essere quenciata da Trp via energy transfer = studi di distanza luorescenza di Phe può essere vista solo in assenza di Trp e Tyr

15 Amino acid Lifetime Absorption luorescence Wavelength Absorptivity Wavelength Quantum Tryptophan 2.6 ns 280 nm nm 0.20 Tyrosine 3.6 ns 274 nm nm 0.4 Phenylalanine 6.4 ns 257 nm nm 0.04

16 luorofori esogeni Un probe fluorescente è un fluoroforo disegnato per legarsi a una regione specifica di una macromolecola o per rispondere a un particolare stimolo. AS (-Anilino-8- napthalene sulphonate (proteine) luorescin (proteine) Ethidium bromide (DA) Acridine orange (DA)

17 Bromuro di e,dio Il bromuro di e=dio si intercala a DA o RA. Quando è legato, la sua fluorescenza è significa=vamente maggiore rispe@o a quando è in soluzione acquosa. E possibile studiare denaturazione del DA Microscopia in fluorescenza Usando marker fluorescen= che si legano a specifici organelli o a specifiche sostanze si possono o@enere mappe di distribuzione di una sostanza biologica assorbita o di organelli esponendo la coltura a luce UV