CROMATOGRAFIA. Principio. Promemoria! I componenti di una miscela sono separati

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1 CROMATOGRAFIA Principio I componenti di una miscela sono separati Promemoria! Dopo la separazione, i componenti raggiungono un rivelatore che dà luogo ad un segnale proporzionale alla loro concentrazione. Essi vengono identificate sulla base del tempo impiegato a raggiungere il rivelatore (tempo di ritenzione)

2 CROMATOGRAFIA Classificazione CROMATOGRAFIA SU COLONNA PLANARE LIQUIDA (LC) GAS - CROMATOGRAFIA (GC) A FLUIDO SUPERCRITICO (SFC)

3 GASCROMATOGRAFIA Fase stazionaria: liquido o solido (in colonna) Fase mobile: gas Principio I soluti sono volatilizzati e iniettati in testa alla colonna L iniettore e la colonna sono ad alta temperatura Il gas fluisce attraverso la colonna I soluti si ripartiscono tra la F.S. (che tende a trattenerli) e la F.M. (quando volatilizzano in seguito all alta temperatura) La fase mobile non ha interazioni specifiche con i soluti ma ha solo effetto di trascinamento La separazione dipende da: Affinità dei soluti per la F.S. Volatilità dei soluti

4 CLASSIFICAZIONE a. Cromatografia gas- liquido (GLC) Fase stazionaria: liquido Fase mobile: gas Separazione: i soluti si sciolgono nel liquido - il gas li trascina b. Cromatografia gas- solido (GSC) Fase stazionaria: solido Fase mobile: gas Separazione: i soluti si adsorbono sulla F.S. - il gas li trascina La tecnica più usata è la GLC.

5 GC - STRUMENTAZIONE

6 GC - COMPONENTI DELLA STRUMENTAZIONE Bombola di gas Regolatore di pressione Regolatore di flusso Partitore di flusso: una parte della FM va direttamente al rivelatore (segnale di zero) Iniettore: per introdurre il campione. Può essere una siringa che fora un setto in gomma siliconica, ma esistono anche altre modalità di iniezione (qui non trattate) Colonna: avviene la separazione dei componenti del campione. E inserita in un forno Rivelatore (detector) Sistema di acquisizione ed elaborazione del segnale (computer)

7 COLONNE PER GLC - 1 Colonne impaccate Supporto solido inerte + liquido impregnante Esempi di supporto solido: - terra di diatomee (a base di silicati) opportunamente trattata. Esempio di nome commerciale: Chromosorb P - polimeri organici vari. Esempi di nome commerciale: Chromosorb T, Porapak Liquidi: divisi in 4 classi a seconda della polarità Esempi: idrocarburi a lunga catena (es. squalano, C-30), siliconi (nomi commerciali diversi a seconda delle ditte produttrici: DB, SPB, DOW, OV, SE )

8 COLONNE PER GLC - 2 Caratteristiche del liquido: - bassa volatilità (non deve essere trascinato via dalla fase mobile) - loading = percentuale di liquido = % Struttura delle colonne - vetro, acciaio, rame - lunghezza: 3 m - diametro: 1/4, 1/8 di pollice (~ 3-6 mm) - dimensione delle particelle: m

9 COLONNE PER GLC - 3 Colonne capillari (open tubular) La fase liquida riveste direttamente le pareti interne della colonna Struttura delle colonne - vetro o silice, ricoperte di materiale plastico - lunghezza: m (avvolte in matasse) - diametro: 0,25-0,75 mm Vantaggi rispetto alle colonne impaccate: - tempi più brevi - risoluzione migliore

10 ESEMPI DI FASI STAZIONARIE PER GLC Tratto da E. Mentasti, G. Saini, Analisi Chimica Cromatografica, Ed. Piccin

11 Tipi di gas: elio, azoto, idrogeno FASE MOBILE PER GC Ruolo: trascinamento dei soluti (carrier). Non dà reazioni chimiche SEPARAZIONE IN GC Fattori che influenzano la separazione. Fase stazionaria (conta soprattutto la polarità) Dimensioni della colonna (lunghezza, diametro) Grado di loading (per colonne impaccate) o spessore del film (per colonne capillari) Temperatura. Aumento di temperatura diminuzione di t R Velocità di flusso Sono numerosissime APPLICAZIONI Requisiti degli analiti (quasi sempre organici): volatili termostabili

12 GC - RIVELATORI Il rivelatore (detector) fornisce un segnale di intensità proporzionale alla concentrazione di analita. Proprietà dei soluti sfruttate per la rivelazione: conducibilità termica formazione di ioni ed elettroni corrente elettronegatività emissione di radiazioni Il gas-cromatografo può essere interfacciato ad altri strumenti utilizzati come rivelatori (spettrometro di massa o IR). Si uniscono le capacità separative della GC con le capacità identificative di altre tecniche.

13 RIVELATORE A TERMOCONDUCIBILITA Principio Due filamenti caldi (termistori): uno è investito dal flusso di gas che non è entrato in colonna, l altro da quello che esce. : La resistenza dei filamenti dipende da T ed è influenzata dalla composizione del gas che circonda i filamenti (diversa dissipazione del calore) In presenza di specie eluite dalla colonna la temperatura e quindi la resistenza dei filamenti varia e la variazione viene segnalata dal rivelatore Caratteristiche Rivelatore universale Poco sensibile

14 Principio RIVELATORE A IONIZZAZIONE DI FIAMMA (Flame Ionization Detector, FID) Il gas in uscita dalla colonna è miscelato con idrogeno e la miscela viene fatta bruciare in eccesso di aria. Quando c è solo gas di trasporto, non si ha praticamente formazione di ioni. In presenza di soluti organici, in seguito ad una serie di reazioni, nella fiamma si produce un flusso di ioni positivi ed elettroni e quindi una corrente tra due elettrodi L ugello è uno degli elettrodi e l altro è un cilindro posto intorno alla fiamma. Applicazioni Composti organici

15 Principio RIVELATORE A CATTURA DI ELETTRONI (Electron Capture Detector, ECD) Un materiale radioattivo emette particelle molto energetiche che producono una ionizzazione del gas di trasporto. Supponendo che si tratti di Ar: Ar Ar + + e Gli ioni positivi e gli elettroni formati migrano rispettivamente verso un catodo e un anodo. si genera una corrente elettrica. Quando dalla colonna viene eluito un soluto organico contenente sostituenti elettronattrattori, questo assorbe una frazione di elettroni diminuzione di corrente Nota La corrente che si genera nel circuito è dovuta prevalentemente agli elettroni. Gli ioni negativi che si producono per effetto della cattura di elettroni hanno una mobilità e quindi una conducibilità elettrica molto minore. Si ha quindi una diminuzione del flusso di corrente nel circuito e questo permette di rivelare il componente eluito.

16 Applicazioni RIVELATORE A CATTURA DI ELETTRONI (Electron Capture Detector, ECD) Composti organici contenenti sostituenti elettronattrattori. Esempi: Solventi clorurati Pesticidi Configurazione di tipo pianoparallelo 1: ingresso eluente 2: sorgente emittente 3: diffusore 4: anodo 5: catodo 6: isolante 7: uscita gas Configurazione di tipo coassiale 1: ingresso eluente 2: sorgente emittente 4: anodo 5: catodo 6: isolante 7: uscita gas

17 INTERFERENZE IN GC Principale interferenza: picchi non ben separati o coeluizione. Si ovvia (quando possibile) migliorando la separazione (agendo su FM, FS, temperatura ). Per identificare una sostanza con più certezza: - usare due colonne diverse - usare tecnica GC-MS

18 GC - ESEMPI DI APPLICAZIONI Fonte:Supelco

19 GC - ESEMPI DI APPLICAZIONI Fonte: Supelco

20 CROMATOGRAFIA GAS-SOLIDO (GSC) Fase stazionaria: solido Esempi: silice, allumina, carbone attivo Meccanismo di trattenimento: adsorbimento Altra fase stazionaria: setacci molecolari = silicati con canali di diametro 4 20 A I soluti sono separati in base alle dimensioni: quelli di piccole dimensioni penetrano nei canali e sono rallentati. Applicazioni: soluti a basso peso molecolare (ossigeno, azoto, CO 2 ) CH 4 O 2 H 2 N 2 CO Separazione di una miscela di gas mediante GSC minuti 15 Tratto da G. Saini, E. Mentasti, Fondamenti di Chimica Analitica, Ed. UTET La GSC è molto meno utilizzata della GLC

21 GC - MS Principio Gli analiti sono: Separati in un gascromatografo Rivelati in uno spettrometro di massa Funzionamento Tra GC e MS c è un interfaccia passaggio da alta P (nel GC) al vuoto (in MS) Nello spettrometro di massa i soluti sono ionizzati e frammentati. Ogni soluto ha una modalità di frammentazione caratteristica Tramite un rivelatore i frammenti danno luogo ad un segnale di intensità proporzionale alla loro abbondanza relativa. Campione Bombola gas carrier Iniettore Colonna capillare Spettrom. di massa Elaboraz. segnali Dispositivi di riscaldamento Stampa cromatogramma e risultati

22 GC - MS Analisi quantitativa: dall intensità del segnale del rivelatore (riportata nel cromatogramma). Cromatogramma: ad ogni specie separata in colonna corrisponde un picco. L area del picco è proporzionale alla quantità di analita. Nota Si misura la corrente ionica totale in funzione del tempo di eluizione. La corrente ionica totale è la somma delle correnti generate dai vari frammenti del soluto, con rapporto massa/carica diverso, che raggiungono il rivelatore di ioni Analisi qualitativa: dallo spettro di massa (grafico abbondanza vs rapporto massa/carica di ogni frammento) Per confronto con una libreria di spettri (oppure registrando lo spettro di uno standard puro) si identifica l analita La tecnica GC-MS è un potentissimo metodo di indagine per l analisi di miscele complesse in quanto combina le capacità di separazione della GC con la capacità di identificazione e caratterizzazione della struttura della MS Applicazioni: come la GC, cioè molecole organiche di varia natura (idrocarburi aromatici, composti alifatici e aromatici alogenati, fenoli, amine ) volatili e termostabili

23 GC - MS - ESEMPI DI APPLICAZIONE

24 GC - MS - ESEMPI DI APPLICAZIONE

25 APPLICAZIONI DI INTERESSE DELLE TECNICHE GC E GC-MS Determinazione di componenti volatili in piante medicinali e preparati. Esempi. Determinazione di: flavonoidi, terpeni e sesquiterpeni nella propolis; barbaloina e aloenina in cosmetici contenenti aloe; composti volatili nel mirtillo; residui di pesticidi in camomilla, te, menta e verbena; camazulene in camomilla; composizione degli oli essenziali di menta, rosmarino, lavanda, bergamotto, salvia; sviluppo del contenuto di canfora e altri componenti nell olio essenziale di rosmarino e di lavanda (studio del momento migliore per il raccolto); composizione dell olio essenziale di timo (studio della variabilità genetica); oli essenziali di camomilla, menta, salvia (studio del trasferimento di componenti nei tessuti.